Анализ клеточного цикла антиген-специфичных CD8+ Т-клеток

Аннотация

Источник: Simonetti, S., et al. Анализ проточной цитометрии на основе ДНК/Ki67 для анализа клеточного цикла антиген-специфических CD8 Т-клеток у вакцинированных мышей. J. Vis. Exp. (2021)

Это видео демонстрирует анализ антиген-специфичных CD8⁺ Т-клеток на разных стадиях клеточного цикла. Флуоресцентно меченные жизнеспособные клетки отбирают с помощью проточной цитометрии, а клетки на разных стадиях клеточного цикла идентифицируют по содержанию их ДНК с использованием антител против ядерного белка, связанного с пролиферацией клеток, и окрашивания нуклеиновой кислотой.

Протокол

1. Приготовление среды и окрашивающего раствора

1. Готовьте полную среду: среда Roswell Park Memorial Institute (RPMI) с 2 мМ глутамина, 100 ЕД/мл пенициллина/стрептомицина, 50 мкМ бета-меркаптоэтанола и 10% объема/объема (v/v) фетальной бычьей сыворотки (FBS)
2. Приготовьте буфер для окрашивания: фосфатно-солевой буфер без Ca²⁺/Mg²⁺ (PBS) с 1% вес/объем (w/v) бычьего сывороточного альбумина (BSA) и 2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты динатриевой соли (ЭДТА)

2. Лечение у мышей

1. Прайм 7-8-недельным самкам мышей Balb/c путем внутримышечной (в/м) инъекции в квадрицепсы вируса иммунодефицита человека (ВИЧ)-1-gag-экспрессирующего-аденовирусного вектора шимпанзе (ChAd3-gag) с дозой 10⁷ вирусных частиц.
2. Через 1-4 месяца после прайминга мышам однократно проводят бустирование путем внутримышечной инъекции HIV-1-gag-экспрессирующего модифицированного вируса коровьей оспы Анкары (MVA-gag) в дозе 10⁶ бляшкообразующих единиц.
3. На 3-й день после бустации принесите в жертву мышей, получивших буст, из-за вывиха шейки матки и анализируйте их параллельно с мышами, не получавшими лечения.
4. Соберите лимфатические узлы (ЛН), дренирующие четырехглавые мышцы (подвздошные, подколенные и паховые) и селезенку у мышей, получавших и не получавших лечения. Кроме того, соберите костный мозг (БМ) с двух задних лап у необработанных мышей и используйте этот КМ для настройки проточного цитометра и в качестве положительного контроля для анализа клеточного цикла (рис. 1).
   заметка: Сгенерируйте векторы ChAd3-gag и MVA-gag, как описано ранее.

3. Изоляция дренирующего ЛН, селезенки

1. Выделение клеток селезенки и LN
   1. Поместите по 5 мл готовой среды в каждую из двух пробирок объемом 15 мл и держите их на льду, готовые к сбору органов.
   2. Принесите в жертву взрослую мышь при вывихе шейки матки.
   3. Положите мышь на заднюю часть и простерилизуйте поверхность кожи 70% v/v этанолом.
   4. Чтобы собрать паховые ЛН, сделайте ножницами продольный разрез на животе ~1 см, а щипцами растяните разрез.
   5. Визуализируйте паховые ЛН на внутренней поверхности кожи и соберите их с помощью щипцов. Поместите паховые LN в одну из двух пробирок объемом 15 мл, приготовленных на шаге 3.1.1.
   6. Чтобы собрать селезенку, сделайте ножницами надрез брюшины и удалите селезенку. После разрезания окружающей соединительной ткани поместите селезенку во вторую пробирку объемом 15 мл, подготовленную на шаге 3.1.1.
   7. Чтобы собрать подвздошные ЛН, отодвиньте кишечник в сторону и визуализируйте ЛН подвздошной кости рядом с нижней полой веной, а затем соберите их с помощью щипцов. Поместите подвздошные LN в ту же трубку, в которой находятся паховые LN.
      заметка: Чтобы получить достаточное количество LN-клеток для окрашивания (см. раздел 4), часто необходимо объединить подколенные, паховые и подвздошные LN от одной мыши. Все эти ЛН дренируют квадрицепсы (место внутримышечной вакцинации). В этом протоколе используется только одна 15 мл пробирки объединенных LN.
   8. Чтобы собрать подколенные LN, возьмитесь за кожу задних лап и аккуратно потяните ее вниз, чтобы обнажить мышцы. Затем вставьте щипцы между мышцами под коленным суставом и соберите подколенные LNs. Поместите подколенные LN в ту же трубку, содержащую паховую и подвздошную LNs.
      заметка: Смотрите примечание после пункта 3.1.7.
   9. Поместите селезенку в сетчатое фильтр для клеток размером 70 мкм в культуральную чашку диаметром 60 мм, заполненную 5 мл готовой среды. С помощью поршня шприца объемом 5 мл аккуратно разомните орган до полного его распыления.
   10. Снимите сетчатое фильтр и переложите клеточную суспензию в чистую пробирку объемом 15 мл.
   11. Добавьте 5 мл готовой среды в чашку для культивирования и тщательно вымойте чашку и ситечко, чтобы убедиться, что все клетки были восстановлены. Объедините с остальной суспензией клеток селезенки в трубку объемом 15 мл.
   12. Для объединенных паховых, подвздошных и подколенных LN приготовьте одноклеточную суспензию, следуя процедуре, аналогичной той, которая использовалась на этапах 3.1.9 - 3.1.11 для селезенки.
   13. Центрифугируйте клетки при 400 × г в течение 10 мин при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточные гранулы в PBS.
   14. Подсчитайте клетки с помощью камеры Нейбауэра, используя буфер для лизиса эритроцитов и 0,04% v/v трипанового синего в PBS.

4. Окрашивание селезенки, LN

1. Разделить образцы клеток для окрашивания на 3 подгруппы: образцы клеток для компенсации, включая клетки КМ от необработанных мышей, которые должны быть окрашены только методом Hoechst 33342 (далее именуемые Hoechst), и клетки селезенки от необработанных мышей для использования для приготовления смеси мертвых/живых клеток для компенсации красителя мертвых клеток; положительный контроль для анализа клеточного цикла, состоящий из образца КМ от необработанных мышей; и экспериментальные образцы, содержащие образцы селезенки и LN от необработанных и вакцинированных мышей.
   заметка: Убедитесь, что клеток селезенки и LN достаточно для анализа достаточного количества Gag-специфичных CD8 Т-клеток. Часто бывает необходимо использовать объединенные клетки селезенки и объединенные клетки LN от 3 вакцинированных мышей и окрашивать два или более идентичных образца объединенных клеток, каждый из которых содержит 3 × 10⁶ клеток. Объедините идентичные образцы на этапе окрашивания по методу Хёхста. Аналогичным образом окрашивают клетки селезенки и LN от 3 необработанных мышей, а в конце объединяют идентичные образцы. Отложите неокрашенный образец клеток селезенки от необработанной мыши для использования в качестве инструмента и настройки компенсации.
2. Приготовьте смесь мертвых/живых клеток для компенсации красителя мертвых клеток (эта смесь клеток будет окрашиваться только мертвым клеточным красителем).
   1. Нагрейте водяную баню до 65 °C.
   2. Возьмите аликвоту клеток селезенки (~3 × 10,⁶).
   3. Перенесите клеточную суспензию в микрофугированную пробирку, поместите ее на водяную баню при температуре 65 °C на 5 минут, а затем сразу же поместите на лед на 10 минут.
   4. Смешайте убитые теплом клетки с живыми клетками селезенки (~3 × 10⁶) в соотношении 1:1 и переложите половину смеси на 96 хорошо круглую нижнюю пластину (~3 × 10⁶ клеток/лунку для контроля окрашивания мертвых клеток).
3. Окрашивание мертвых клеток экспериментальных образцов, положительный контроль для анализа клеточного цикла и смешение мертвых и живых клеток
   1. Перенесите селезенку, ЛН, клетки КМ (3 × 10⁶ клеток/лунку) и смесь мертвых/живых клеток (раздел 4.2) в 96-луночный планшет с круглым дном, согласно схеме окрашивания (шаг 4.1), и центрифугируйте при 400 × г в течение 3 мин при 4 °С.
   2. Повторно суспендируйте каждую клеточную гранулу в 50 мкл красителя для мертвых клеток, разведенного в PBS, и повторно суспендируйте путем пипетирования вверх и вниз 3 раза немедленно.
   3. Выдерживать в течение 30 минут при температуре 4 °C, в защищенном от света месте.
   4. Промойте ячейки 2 раза с окрашивающим буфером, первый раз с 200 μL и второй раз с 250 μL. Для каждой промывки центрифугируйте планшет при 400 × г в течение 3 мин при 4 °C.
   5. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 20 мкл PBS.
4. Окрашивание мембранных клеток мультимерами большого комплекса гистосовместимости (MHC)-пептида и моноклональными антителами (mAb).
   1. Учитывая необходимые объемы по схеме окрашивания (Настройки проточного цитометра, табл. 1), готовят следующие реагенты:
      1. Разведите mAb 2,4G2 в буфере для окрашивания в соответствии с соответствующим разбавлением (см. Таблицу материалов); для каждого образца, который необходимо окрашивать, используйте 10 мкл этого раствора><. Примечание: 2,4G2 mAb блокирует неантиген-специфическое связывание иммуноглобулинов с рецепторами FcγIII и FcγII.
      2. Разбавьте тетрамер, меченный H-2k(d) аллофикоцианином (APC) H-2k(d) AMQMLKETI (APC) (Tetr-gag) в буфере для окрашивания для получения соответствующего разбавления (см. Таблицу материалов); для каждого образца, подлежащего окрашиванию, используйте 20 мкл этого разведения.
      3. Приготовьте смесь антител путем разведения mAb в окрашивающем буфере в соответствии с соответствующим разведением (см. Таблицу материалов), которое было предварительно определено в экспериментах по титрованию; для каждого образца, подлежащего окрашиванию, используйте 20 мкл этой смеси антител><. заметка: Здесь использовали анти-CD3e перидинин хлорофилл белок (PerCP-Cy5.5) (клон 145-2C11), анти-CD8a блестящий ультрафиолет (BUV805) (клон 53-6,7) и анти-CD62L фикоэритрин цианин7 (PECy7) (клон MEL-14).
   2. Добавьте 10 μL ранее разведенного 2,4G2 mAb (шаг 4.4.1.1) и инкубируйте в течение 10 минут при 4 °C, защищенном от света.
   3. Добавьте 20 мкл ранее разведенного Tetr-gag APC (шаг 4.4.1.2) и 10 мкл H-2k(d) пентамера амкммлкети фикоэритрина (ПЭ) (пент-гаг). Выдерживать в течение 15 минут при температуре 4 °C в защищенном от света месте.
   4. Добавьте 20 мкл заранее приготовленной смеси антител (шаг 4.4.1.3), и инкубируйте в течение 15 мин при 4 °С, защищенном от света.
      заметка: Таким образом, конечный объем составляет 80 мкл на лунку (шаг 4.3.5, шаги 4.4.2 - 4.4.4).
   5. Промойте ячейки 200 мкл буфера для окрашивания. Центрифугировать при 400 × г в течение 5 мин при 4 °C.
   6. Повторно суспендируйте клеточную гранулу в 250 мкл окрашивающего буфера и перенесите клеточную суспензию в пробирки объемом 5 мл. Добавьте в пробирку 1 мл буфера для окрашивания и центрифугируйте при 400 × г в течение 5 минут при 4 °C.
   7. Возьмите аликвоту клеток КМ (3 × 10⁶ клеток) (см. список образцов клеток, раздел 4.1), которые будут использоваться для компенсации канала Хёхста (Hoechst 33342 возбуждается ультрафиолетовым лазером (настройки проточного цитометра (Таблица 2)), и перенесите клеточную суспензию в пробирку объемом 5 мл. Добавьте в пробирку 1 мл буфера для окрашивания и центрифугируйте 400 × г в течение 5 минут при 4 °C.

5. Фиксация/пермеабилизация

1. Приготовьте свежий буфер для фиксации/пермеабилизации, разбавив 1 часть концентрата фиксации/пермеабилизации с 3 частями разбавителя для фиксации/пермеабилизации, в соответствии с инструкциями производителя.
2. Выбросьте надосадочную жидкость и импульсный вихревой поток образцов для полного дезагрегирования гранул.
3. Добавьте 1 мл свежеприготовленного буфера для фиксации/пермеабилизации в каждую пробирку, включая пробирку с неокрашенными клетками селезенки (3 x 10⁶, см. список образцов клеток, раздел 4.1), и вортекс.
4. Инкубировать в течение 16 ч при 4 °C.
   заметка: Протокол можно поставить на паузу здесь.

6. Внутриклеточное окрашивание

1. Окрашивание Ki67
   1. Приготовьте свежий буфер для пермеабилизации 1x, разбавив буфер для пермеабилизации 10x дистиллированной водой, в соответствии с инструкциями производителя. Перед использованием пермеабилизационный буфер 1x необходимо отфильтровать через фильтр 0,45 мкм для удаления агрегатов.
   2. Разведите mAb Ki67 флуоресцеин изотиоцианат (FITC) (клон SolA15) в буфере для пермеабилизации 1x (см. Таблицу материалов), как было определено ранее в экспериментах по титрованию (конечный объем 100 мкл на образец).
   3. Добавьте 3 мл пермеабилизационного буфера 1x в каждую пробирку и центрифугируйте при 400 × г в течение 5 минут при комнатной температуре (RT).
   4. Выбросьте надосадочную жидкость и повторите шаг 6.1.3.
   5. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 100 мкл ранее разведенного mAb Ki67 FITC (шаг 6.1.2).
   6. Инкубировать в течение 30 минут при RT в защищенном от света месте.
   7. Промойте ячейки 2 раза 4 мл пермеабилизационного буфера 1х. Для каждой промывки центрифуга по 400 × г в течение 5 мин по RT.
   8. Ресуспендию клеточной таблетки в PBS с учетом следующих объемов: 350 мкл PBS для образцов, которые должны быть получены непосредственно на проточном цитометре; 250 μл PBS для образцов, инкубируемых с помощью Hoechst незадолго до проточной цитометрии (раздел 6.2).
2. Окрашивание ДНК
   1. Добавьте 250 мкл 4 мкг/мл Hoechst в PBS в каждый образец (конечная концентрация Hoechst составляет 2 мкг/мл).
      ПРИМЕЧАНИЕ: В случае, если были приготовлены два или более идентичных образца по 250 мкл в PBS, объедините их на этом этапе и добавьте равный объем 4 мкг/мл раствора Hoechst в PBS (конечная концентрация Hoechst составляет 2 мкг/мл). Количество клеток сильно влияет на этап окрашивания ДНК. Используйте один и тот же номер ячейки в каждом образце. Имейте в виду, что даже незначительное уменьшение количества клеток (например, из-за потери клеток на предыдущих этапах промывки) приводит к более высокому связыванию Хёхста с ДНК и более высокой интенсивности Хёхста.
   2. Инкубировать в течение 15 минут при RT в защищенном от света месте.
   3. Центрифугируйте образцы при 400 × г в течение 5 мин при RT.
   4. Ресуспендируйте клеточную таблетку в 350 мкл PBS.

7. Подготовка образцов компенсационных бусин

1. Приготовьте 5 мкл антитела, соответствующим образом разбавив mAb в буфере для окрашивания.
   заметка: Для каждого использованного в эксперименте флуорохром-конъюгированного mAb готовят соответствующий образец компенсационного шарика.
2. Vortex Negative Control и Anti-Rat/Hamster Ig,κ Comp бусины перед использованием.
3. Для каждого образца введите одну каплю (~20 μл) Negative Control CompBeads и одну каплю Anti-Rat/Hamster Ig,k CompBeads.
4. Добавьте 5 мкл предварительно разведенного антитела (шаг 7.1) в пробирку и пипетируйте вверх и вниз.
5. Выдерживать в течение 15 минут при температуре 4 °C в защищенном от света месте.
6. Промойте образцы 2 мл буфера для окрашивания. Центрифугировать при 400 × г в течение 5 мин при 4 °C.
7. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу, добавив 500 мкл PBS в каждую трубку и вихрь.

8. Установка прибора и компенсации и получение экспериментального образца на проточном цитометре

ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к настройкам проточного цитометра (Таблица 2) для настройки цитометра.

1. Общая настройка прибора и компенсации
   1. Откройте программное обеспечение для получения образцов (см. Таблицу материалов) и создайте новый эксперимент, нажав «Новый эксперимент» в разделе ленты рабочего пространства и выбрав «Новый пустой эксперимент».
   2. Дважды щелкните по созданному эксперименту, чтобы открыть его.
   3. В окне «Настройки цитометра» нажмите «Параметры» и выберите все каналы (например, PE, APC и т. д.), используемые на панели окрашивания, включая параметры прямого рассеяния (FSC) и бокового рассеяния (SSC).
   4. Выберите линейную шкалу в качестве параметра Хёхста, сняв галочку с логарифмической шкалы, и проверьте Ширину (Вт) импульса напряжения для FCS, SSC и Hoechst.
      заметка: Все параметры по умолчанию отображаются в логарифмическом (логарифмическом) масштабе, за исключением FSC и SSC, которые представлены в линейном масштабе. Все параметры анализируются по площади (A) и высоте (H) импульса напряжения.
   5. На глобальном листе создайте точечную диаграмму с FSC-A по оси X и SSC-A по оси y.
   6. Запустите образец неокрашенной селезенки, щелкнув Получить данные на панели мониторинга.
   7. Установите соответствующие настройки FSC и SSC для визуализации ячеек, изменив значения напряжения в разделе Параметры, и создайте вентиль для выбора всех ячеек, отображаемых на точечной диаграмме FSC-A/SSC-A, щелкнув по кнопке Полигональный вентиль на панели инструментов рабочей области глобального рабочего листа.
   8. Отображение стробируемых ячеек в гистограммах с каждым параметром флуоресценции по оси x.
   9. Запустите неокрашенные и полностью окрашенные образцы селезенки, чтобы настроить флуоресцентный детектор (ФЭУ) таким образом, чтобы иметь четкое разделение между отрицательными и положительными сигналами окрашенных клеток для каждого параметра флуоресценции.
   10. Чтобы выполнить настройку компенсации, нажмите «Экспериментировать» на ленте рабочего пространства и в разделе «Настройка компенсации» выберите «Создать элементы управления компенсацией». Снимите флажок «Включить неокрашенную контрольную трубку/колодец» и нажмите OK.
       заметка: В результате этой операции будет создан образец с именем Compensation Controls и обычный рабочий лист, содержащий несколько листов, соответствующих каждому выбранному параметру.
   11. Запустите образец компенсационных бусин (см. раздел 6); установите соответствующие настройки FSC и SSC для визуализации бусин, изменив значения напряжения и порог захвата 5000 для параметров FSC в окне Цитометр.
   12. Отрегулируйте вентиль P1 на поверхности валика и убедитесь, что положительный и отрицательный пики видны на оси x. Повторите эту операцию для каждого образца компенсационного валика и, наконец, запишите каждый файл образца, нажав кнопку «Записать данные» на панели сбора данных (запишите не менее 5 000 событий для каждого образца).
   13. Для каждого записанного образца бусины установите вентили P2 и P3 на положительные и отрицательные пики соответственно.
   14. Запустите образцы ячеек для компенсации (см. шаги 4.2 и 4.4.7, а также разделы 5 и 6). Измените напряжения FSC и SSC, а также пороговое значение для визуализации ячеек, отрегулируйте вентиль P1 и, наконец, запишите каждый файл образца (запишите не менее 10 000 событий). Установите вентили P2 и P3 на положительные и отрицательные пики соответственно.
       заметка: Для компенсации канала Хёхста используйте G₀/G₁ в качестве отрицательного пика (P3) и G₂/M в качестве положительного (P2).
   15. Нажмите «Экспериментировать» в разделе ленты рабочего пространства и в разделе «Настройка компенсации» выберите «Рассчитать компенсацию».
   16. Назовите созданную настройку компенсации, дайте ссылку и сохраните ее в текущем эксперименте.
2. Приобретение экспериментальных образцов
   1. Откройте образец, нажав кнопку "Новый образец" на панели инструментов браузера, и создайте стратегию стробирования на глобальном листе.
      заметка: Стратегия отбора проб аналогична стратегии анализа проб, описанной на рисунке 2 и в разделе 9.
   2. Отображение всех популяций событий в гистограмме с CD3-A по оси x. Создайте интервальный вентиль для выбора только ячеек CD3⁺.
   3. На панели сбора данных выберите шлюз хранилища в качестве Все события для образцов LN и либо Все события, либо CD3⁺ клетки для образцов селезенки.
   4. Запустите экспериментальные образцы на низкой скорости и, наконец, запишите все файлы, убедившись, что вы собрали не менее 100-200 антиген-специфичных CD8 Т-клеток для каждого образца от вакцинированных мышей.
      заметка: Размер файла экспериментальных образцов обычно велик (30-120 МБ), особенно при низкой частоте антиген-специфичных CD8 Т-клеток. Следовательно, большое количество событий (> 1 ×^{10 6}) должно быть собрано для регистрации по меньшей мере 100-200 антиген-специфических CD8 Т-клеток. Большие файлы могут замедлить последующий процесс анализа данных. Получение только CD3⁺ клеток в образцах селезенки (см. шаг 8.2.2 выше) полезно для уменьшения размера файла.
   5. Запустите и запишите положительный контроль для анализа клеточного цикла, т.е. образец КМ от необработанных мышей.

9. Анализ данных

1. Откройте программное обеспечение (см. Таблицу материалов) и создайте различные группы, соответствующие различным анализируемым органам, нажав кнопку "Создать группу" в разделе ленты рабочего пространства (т.е. создайте группу "a-LNs"; "b-spleen"; "c-BM").
   заметка: Вновь созданные группы появятся в списке групп, в то время как группа «Компенсация» будет автоматически сгенерирована программным обеспечением.
2. Откройте окно «Изменить группу», дважды щелкнув по имени группы, и убедитесь, что вновь созданные группы синхронизированы. Если нет, поставьте галочку на функцию Синхронизировано.
3. Перетащите каждый файл .fcs в соответствующую группу.
4. Создайте стратегию стробирования, начиная с группы "a-LNs".
5. Дважды щелкните по полностью окрашенному образцу в группе, чтобы открыть окно графика; оси x и y помечены так же, как в файлах fcs (см. настройки проточного цитометра, таблица 2).
6. Отобразите общее количество событий, полученных для этого образца, на точечной диаграмме с DNA-A по оси x и DNA-W по оси y.
7. Выберите только одну популяцию ячеек, нажав на кнопку "Прямоугольник" в разделе инструмента стробирования в окне графика.
   заметка: Одиночные клетки имеют следующие значения DNA-A: 2N (низкий): между 2N и 4N (промежуточный) или равный 4N (высокий), при этом значения DNA-W идентичны для всех них (шаг 1 рис. 2).
8. Дважды щелкните мышью в центре прямоугольного затвора, чтобы отобразить отдельные ячейки на точечной диаграмме с параметром FSC-A по оси X и красителем мертвых клеток по оси y.
9. Выберите только живую популяцию клеток, щелкнув по Polygon в разделе инструмента стробирования в окне графика. Живые клетки отрицательны на краситель мертвых клеток (шаг 2 на рисунке 2).
10. Дважды щелкните мышью в центре многоугольного затвора, чтобы отобразить ячейки на точечной диаграмме с параметром FSC-A по оси X и параметром SSC-A по оси y.
11. Нажмите на Rectangle и создайте «расслабленный» вентиль, чтобы включить в него все отдельные живые ячейки на этом графике (шаг 3 на рисунке 2).
12. Дважды щелкните в центре «расслабленного» затвора, чтобы отобразить ячейки в виде точечной диаграммы с CD3 по оси x и CD8 по оси y.
13. Выделите ячейки CD3⁺CD8⁺, щелкнув по Polygon (шаг 4 на рисунке 2).
14. Дважды щелкните в центре элемента CD3⁺CD8⁺, чтобы отобразить ячейки на точечной диаграмме с Tetr-gag по оси x и Pent-gag по оси y.
15. Выберите антиген-специфичные CD8 Т-клетки (положительные как на Tetr-gag, так и на Pent-gag), нажав на Polygon (шаг 5 на рисунке 2).
16. Дважды щелкните мышью в центре специфичного для gag затвора, чтобы отобразить клетки на точечной диаграмме с DNA-A по оси x и Ki67 по оси y (рис. 3).
17. Выберите ячейки в различных фазах клеточного цикла, щелкнув по кнопке Quad в разделе инструмента стробирования в окне графика.
    заметка: Клетки в фазе G₀ — это клетки с низким уровнем Ki67neg-ДНК (нижний левый квадрант); клетки в G₁ имеют низкий уровень Ki67pos-ДНК (верхний левый квадрант); клетки в S-G2/M относятся к Ki67pos-ДНК промежуточного/высокого (верхний правый квадрант) (рисунок 3).
18. Скопируйте стратегию стробирования, созданную в одном образце, в соответствующую группу, чтобы применить стробы ко всем образцам группы.
19. Повторите шаги с 9.5 по 9.18 для группы a-LN.
20. Убедитесь, что все ворота подходят для каждого образца группы «b-селезенки». Чтобы проанализировать клеточный цикл среди клеток КМ (положительный контроль), щелкните в центре «расслабленного» затвора, чтобы отобразить клетки на точечном графике с DNA-A по оси x и Ki67 по оси y.
21. Убедитесь, что все вентили подходят для каждого образца из 3 групп (т.е. для клеток селезенки, LN и BM).
    заметка: Одноклеточный популяционный гейт (шаг 9.7) и четырехклеточный гейт для клеточного цикла (шаг 9.17) могут иметь разные координаты затвора в разных образцах, в основном из-за возможных незначительных различий в интенсивности красителя Хёхста между образцами (раздел 6.2). По этой причине, возможно, потребуется модифицировать одноклеточный популяционный вентиль и четырехклеточный вентиль для клеточного цикла в каждом образце. Это будет сделано следующим образом: дважды кликните по названию группы, и удалите синхронизацию из свойств группы. Эта операция позволяет модифицировать затворы в одном образце без модификации тех же стробов во всех остальных образцах группы. После удаления синхронизации при необходимости модифицируйте стропы.
22. Чтобы визуализировать результаты, полученные в результате этого анализа, нажмите на кнопку «Редактор макетов» в разделе ленты рабочего пространства, чтобы открыть его. Перетащите каждый элемент стратегии стробирования на панели образца в редактор компоновки и разместите графики в соответствии с последовательностью стратегии стробирования. При необходимости измените тип графика, дважды щелкнув по соответствующему графику в компоновке и выбрав соответствующий тип в окне Определение графика.
23. Нажмите на кнопку «Группа» и выполните итерацию по функциям на ленте макета, чтобы визуализировать результаты, полученные в каждом органе, и сравнить различные образцы.

Таблица 1: Настройки проточного цитометра.

образец	Панель антител
Полное окрашивание	ФИТК Ki67	CD3 PercpCy5.5	БТР с кляпом	FVD eFluor 780	Hoechst 33342	КД8 БУВ805	Пент-кляп ПЭ
Ki67 FMO		CD3 PercpCy5.5	БТР с кляпом	FVD eFluor 780	Hoechst 33342	КД8 БУВ805	Пент-кляп ПЭ
Тетр-кляп APC FMO	ФИТК Ki67	CD3 PercpCy5.5		FVD eFluor 780	Hoechst 33342	КД8 БУВ805	Пент-кляп ПЭ
Пент-кляп PE FMO	ФИТК Ki67	CD3 PercpCy5.5	БТР с кляпом	FVD eFluor 780	Hoechst 33342	КД8 БУВ805
CD8 FMO	ФИТК Ki67	CD3 PercpCy5.5	БТР с кляпом	FVD eFluor 780	Hoechst 33342		Пент-кляп ПЭ
CD3 FMO	ФИТК Ki67		БТР с кляпом	FVD eFluor 780	Hoechst 33342	КД8 БУВ805	Пент-кляп ПЭ
Изменяемая жизнеспособность красителя FMO	ФИТК Ki67	CD3 PercpCy5.5	БТР с кляпом		Hoechst 33342	КД8 БУВ805	Пент-кляп ПЭ
Hoechst 33342 FMO	ФИТК Ki67	CD3 PercpCy5.5	БТР с кляпом	FVD eFluor 780		КД8 БУВ805	Пент-кляп ПЭ

Таблица 2: Настройки проточного цитометра.

инструмент	BD LSR Fortessa
лазер	Синий 488 нм		Красный 639nm		UV 355nm		Желтый/зеленый 561nm
Полосовые фильтры	530/30	710/50	670/14	780/60	530/30	820/60	585/15	780/60
Фильтры длинного пропускания	505ЛП	685LP		750LP	505ЛП	770LP		750LP
Используемые флуорохромы/красители	ФИТК	PERCPCY5.5	БТР	Флюор 780	Hoechst 33342	БУВ805	ПЭ	ПЕЦИ7
Соответствующее имя в файлах fcs	Алекса Флюор 488	PERCPCY5.5	БТР	БТР-Н7	Хёхст-Ред	БУВ737	ПЭ	ПЕЦИ7

Результаты

Рисунок 1: Анализ клеточного цикла клеток БМ. Клетки КМ от необработанных мышей Balb/c окрашивали и анализировали с помощью проточной цитометрии. (A) Пример стратегии стробирования. Мы стробировали на одиночных клетках на графике ДНК-A/-W (слева), а затем на живых клетках путем исключения красителя мертвых клеток (в центре). Затем для всех элементов BM был использован «расслабленный» затвор FSC-A/SSC...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
1-200 μл универсальные наконечники для пипеток в объемной упаковке	Корнинг	CLS4866-1000 шт.
2.4G2 анти-FcγR mAb	БД	553141	10 мкг/мл конечная концентрация
поршень шприца 5 мл	BD Изумруд	307733
Конические тубы 15 мл	MercK Millipore	SBHA025SB
60 мм чашка для клеточных культур, обработанная TC	сокол	353002
Сетчатый фильтр 70 μм	сокол	352097
96-луночный прозрачный микропланшет для культур с круглым дном, обработанным TC	сокол	353077
Частицы компенсации против крыс / хомяка Ig,k / отрицательного контроля	BD- Бионаука	552845
Бета-меркаптоэтанол	сигма	М3148
Бычий сывороточный альбумин	сигма	А07030
BUV805 Крысиный антимышь CD8a	BD- Бионаука	No 564920	4 мкг/мл конечная концентрация
Фосфатный буферный раствор Дульбекко без кальция без магния	Евроклон	ECB4004L
Пробирки Eppendorf Safe-Lock, 1,5 мл	Эппендорф	30120159
этанол	сигма	34852-1Л-М
Этилендиаминтетрауксусная кислота в растворе динатриевой соли (ЭДТА)	сигма	Е7889
Фетальная бычья сыворотка	Корнинг	35-079-ЧВ
Filcon, стерильный, шприц-тип 70 мкм	сокол	No 352350 (Английский
Корректируемая жизнеспособность красителя eFluor 780	eBioscience	Тел.: 65-0865-14	1:1000 финальная концентрация
Foxp3 / Набор буферов для окрашивания транскрипционного фактора	eBioscience	Тел.: 00-5523-00	Этот набор содержит концентрат и разбавитель для фиксации/пермеабилизации, а также буфер для пермеабилизации 10x
H-2k(d) AMQMLKETI аллофикоцианиновый (APC)-меченный тетрамер	предоставлено NIH Tetramer Core Facility		6 мкг/мл конечная концентрация
H-2k(d) AMQMLKETI пентамер, меченный фикоэритрином (ПЭ)	Проиммунный	Ф176-2А-Э - 176	10 μл / образец
Hoechst 33342, Тригидрохлорид, Тригидрат - 10 мг/мл раствор в воде	ТермоФишер	Н3570
Моноклональное антитело Ki-67 (SolA15), FITC	eBioscience	Тел.: 11-5698-82	5 мкг/мл конечная концентрация
L-глютамин 100X (200 мМ)	Евроклон	ECB3000D
Фильтры Millex-HA 0,45 μм	БД	340606
Пенициллин/стрептомицин 100X	Евроклон	ECB3001D
PE/Cyanine7 антитело CD62L к мышам	Биолегенда	104418	0,2 мкг/мл конечная концентрация
PerCP-Cy™5.5 Хомяк против мыши CD3e	BD- Бионаука	551163	4,4 мкг/мл конечная концентрация
Буфер для лизиса эритроцитов	сигма	Р7757
Трубки из полистирола с круглым дном, 5 мл	сокол	352058
RPMI 1640 Medium без L-глютамина с феноловым красным	Евроклон	ECB9006L
Программный комплекс для анализа данных проточной цитометрии	ФлоуДжо	т.10
Программное обеспечение для сбора образцов на проточном цитометре	BD FACSДива	Версия 6.2
Решение Trypan Blue	Евроклон	ECM0990D

)