$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Подготовка материалов к инъекции
- Простерилизовать иглу и шприц 33 G: разобрать и автоклав при 115 οC. Подготовить иглы к инъекции путем повышения в стерильном фосфатно-солевом буфере (PBS).
- Разморозьте флуоресцентно помеченные частицы при комнатной температуре в течение 5 - 10 мин. Приготовьте раствор частиц для инъекций, восстановив его до раствора 50 мг/мл в стерильном PBS с ионом кальция и ионом магния (Ca2+/Mg2+).
заметка: В этом протоколе используются меченые AF488 частицы грибкового происхождения, которые были валидированы для анализа на фагоцитоз. Для оптимального усвоения готовьте частицы свежими и непосредственно перед впрыском.
ПРИМЕЧАНИЕ 2: Концентрации частиц могут быть оптимизированы для каждого конкретного эксперимента.
2. Интравитреальное введение раствора в шариках
ПРИМЕЧАНИЕ: Для выполнения инъекции требуется два человека, таким образом, что человек, выполняющий инъекцию, может держать мышь и сохранять фокус на глазном яблоке, в то время как другой человек пропускает заряженный шприц и нажимает на поршень.
- Обезболивают грызуна путем внутрибрюшинного введения 100 мг/мл кетамина и 10 мг/мл ксилазина в дозе 20 мкл/10 г массы тела. Перед инъекцией используйте зажим для пальца ноги, чтобы оценить уровень анестезии.
заметка: Изофлуран оказывает глубокое влияние на функцию миелоидных клеток, поэтому следует избегать его использования на протяжении всего данного анализа.
- Нанесите на иглу 0,5 мкл раствора флуоресцентно меченых частиц.
- Положите мышь боком под хирургический микроскоп (рисунок 1A-B). Используйте мягкий материал, например, гелевый пакет, для лучшего позиционирования мыши. Для молодых мышей, у которых глаза еще не открыты, аккуратно откройте веки с помощью тонких щипцов под углом 45°, создав вдоль щели щель, из которой веки в конечном итоге откроются.
- С помощью тонких щипцов под углом 45° осторожно надавливайте вокруг века, чтобы глазное яблоко немного выступало из глазницы. Держите голову двумя пальцами чуть выше уха и за челюсть и осторожно растягивайте кожу параллельно векам, чтобы глаз немного не выходил из глазницы. Будьте осторожны, чтобы не хвататься слишком близко к горлу (рисунок 1B).
- Чтобы проколоть глазное яблоко, введите иглу шприца в лимб роговицы (где соединяются роговица и склера). У пигментированных мышей это видно в виде серого круга. Слегка втяните иглу, чтобы вытолкнуть небольшой объем стекловидной жидкости, а затем введите ее. Человек, выполняющий инъекцию, должен аккуратно держать мышь одной рукой, а иглу – другой; Второй человек должен медленно нажимать на поршень.
- Медленно втяните шприц. Наносите увлажняющие капли для глаз, чтобы сохранить глаза увлажненными.
- Дайте грызуну восстановиться в клетке над грелкой и продолжайте следить за животным. Если вы работаете со щенками, не возвращайте животное в клетку с другими бдительными животными до тех пор, пока оно не начнет дышать и не сможет самопроизвольно двигаться. Если вы работаете со взрослыми особями, не возвращайте грызуна в клетку с другими бдительными животными до тех пор, пока он не восстановит лежачее состояние грудины.
3. Забор ткани сетчатки
ПРИМЕЧАНИЕ: Ткань сетчатки из глаз, в которую не вводились флуоресцентно меченые частицы, должна быть собрана в качестве контроля для проточного цитометрического анализа. Хотя анализ может быть выполнен с использованием одной сетчатки, для достижения наилучшей эффективности две сетчатки должны быть объединены вместе.
- Соберите ткань сетчатки через 3 часа после интравитреального введения флуоресцентно меченых частиц.
заметка: В то время как время после инъекции раствора частиц может быть оптимизировано для каждого конкретного эксперимента, мы обнаружили, что через 3 часа после инъекции поглощение частиц может наблюдаться во всех слоях сетчатки (рис. 1C-D).
- Принесите мышей в жертву при шейном вывихе.
- Соберите глазные яблоки, слегка надавливая на веко с помощью тонких щипцов под углом 45°, чтобы проптоизировать глазное яблоко. Расположите щипцы за глазным яблоком и потяните.
- Препарируйте сетчатку под рассекающим микроскопом. Перенесите глазное яблоко в чашку Петри, содержащую небольшое количество PBS с Ca2+/Mg2+. На сухом участке чашки Петри проделайте перфорацию глазного яблока в роговичном лимбе кончиком сверхтонких щипцов.
- Удерживайте глазное яблоко с помощью тонких щипцов под углом 45° и используйте пружинные ножницы, чтобы разрезать вокруг роговичного лимбуса, пока не будет разрезана примерно половина окружности роговичного лимбуса.
- Удерживайте глазное яблоко тонкими щипцами под углом 45° и переведите глазное яблоко в PBS. С помощью второй пары тонких щипцов под углом 45° разорвите роговицу и склеру. Хрусталик и сетчатка кожи выйдут неповрежденными.
- Отделите хрусталик и сетчатку глаза. Соберите сетчатку глаза и перенесите ее в полистирольную пробирку объемом 5,4 мл, содержащую 2 мл PBS с Ca2+/Mg2+.
4. Приготовление суспензии для одиночных клеток
- Одноклеточные суспензии готовят с помощью набора для диссоциации нейрональной ткани с незначительными изменениями в инструкции производителя. Вкратце, растирайте сетчатку, пипетируя вверх и вниз с помощью пипетки P1000 и выполняя ферментативное расщепление при температуре 37 °C без встряхивания.
5. Окрашивание суспензий одиночных клеток для проточного цитометрического анализа
- Ресуспендируют клетки в 200 мкл окрашивающего буфера (фосфатно-солевой буфер Дульбекко с 0,2% бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 0,09% азида натрия) и переносят в U-образный 96-луночный планшет. Центрифуга в течение 5 мин при 130 г <бр/>
заметка: Азид натрия вреден для человека и окружающей среды. Используйте соответствующие средства индивидуальной защиты и выбрасывайте отходы в соответствии с местными правилами.
- Переверните тарелку над раковиной, чтобы сбросить надосадочную жидкость. Чтобы блокировать Fc-рецепторы, ресуспендируйте клетки в 25 мкл красящего буфера, содержащего 5 мкг/мл антитела против мышей CD16/CD32 на лунку. Выдерживать 5 минут при комнатной температуре.
- Добавьте 25 мкл окрашивающего буфера, содержащего 0,5 мкг/мл антимышиного Ly6C-APC-Cy7, 0,5 мкг/мл антимышиного Ly6G-Pe-Cy7 и 2,5 мкг/мл антимышиного CD11b-BV650. Инкубировать в течение 15 мин при комнатной температуре в темноте.
- Центрифугируйте в течение 5 минут при 130 x g. Переверните планшет, чтобы удалить надосадочную жидкость. Промыть, повторно суспензив ячейки в 200 мкл красящего буфера.
- Центрифуга в течение 5 мин при 130 х г. Ресуспендировать в 200 мкл красительного буфера, содержащего 0,5 мкг/мл йодида пропидия (PI). Переложите в пробирки с микротитром объемом 1,2 мл.
- Лунки промыть дополнительными 100 мкл окрашивающего буфера, содержащего 0,5 мкг/мл ПИ, и бассейн с предыдущими 200 мкл в пробирках с микротитрованием объемом 1,2 мл. Получается общий объем 300 мкл окрашенных клеток.
6. Проточный цитометрический анализ
- Используя обычный три лазера (фиолетовый, синий и красный), избегайте попадания красителей PE, PerCP-Cy5.5, BV510 и PI из-за значительного распространения чрезвычайно ярких флуоресцентных частиц AF488. Используйте четвертый (желтый) лазер для оптимизации этого анализа, так как он позволяет использовать меченные ПЭ антитела и PI (в канале mCherry вместо канала PerCP-Cy5.5) (рис. 2).
заметка: Если желтый лазер недоступен, используйте краситель для исключения мертвых клеток в другом канале.
- Затвор на PI-отрицательных клетках (PI-) для исключения мертвых клеток (рис. 2B).
- После исключения мертвых клеток, гейт на CD11b-положительные клетки (CD11b+), сюда войдут все миелоидные клетки (Рисунок 2C).
- В популяции CD11b+ шлюз на Ly6C-/Ly6G- для исключения нейтрофилов (CD11b+/Ly6G+) и моноцитов (CD11b+/Ly6C+; Рисунок 2D). После гейтинга на микроглии (здесь для простоты определяется как CD11b+/Ly6C-/Ly6G-) должны быть видны две чистые популяции; один отрицательный и один положительный для флуоресцентно меченых частиц. Фагоцитарные клетки поглощают частицы и, следовательно, AF488+ (рис. 2E).
заметка: Ly6C-положительные или Ly6G-положительные популяции также могут быть проанализированы для измерения поглощения частиц с использованием этого подхода к окрашиванию. Процент фагоцитарных CD11b+ клеток хорошо коррелирует с процентом фагоцитарной микроглии (рис. 2F). Для исследователей, не имеющих опыта проточной цитометрии, можно провести более простой анализ только с окрашиванием CD11b, хотя это будут фагоцитарные нейтрофилы и моноциты, а также микроглия. В этой популяции CD11b+/Ly6C-/Ly6G- эти клетки на 99% состоят > микроглии, если судить по окрашиванию маркерами F4/80 и CX3CR1; Эти маркеры можно добавлять, но они не обязательно должны быть у нас в руках.
