Анализ проточной цитометрии для идентификации субпопуляций иммунных клеток в мононуклеарных клетках периферической крови

Аннотация

Источник: Torchia, M. L. G., et al. Дискриминация семи субпопуляций иммунных клеток с помощью проточной цитометрии с двумя флуорохромами. J. vis. Exp. (2019)

Это видео демонстрирует технику на основе проточной цитометрии с использованием двух флуорохромов для идентификации CD4⁺ и CD8⁺ Т-клеток, γδ Т-клеток, В-клеток, естественных киллеров (NK) и моноцитов в мононуклеарных клетках периферической крови человека (PBMC). После инкубации клеток с флюорохром-конъюгированными антителами против поверхностных маркеров субпопуляции клеток идентифицируют с использованием стратегии оптимального проточного цитометрического гейтирования.

Протокол

Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол был протестирован на свежих или замороженных изолированных клетках периферической крови и цельной крови.

1. Окрашивание клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Выбор пар флуорохромов практически без спектрального перекрытия важен для уменьшения разброса данных из-за большого распространения флуорохрома в другом детекторе флуорохрома. Для достижения оптимальной идентификации всех субпопуляций клеток следует использовать флуорохромы с высоким квантовым выходом, такие как пары антител PE-BV421 и PE-APC.

1. Окрашивание свежих и замороженных PBMC
   1. Перелейте 100 мкл PBMC (1 x 10⁶ элементов) в 96-луночный планшет с V-образным дном.
      заметка: Любое количество ячеек меньше 1 x^{10 6} может быть использовано с аналогичными результатами.
   2. Центрифугируйте при 350 x g в течение 3 мин при RT и осторожно отсасывайте надосадочную жидкость, не нарушая клеточную гранулу. Добавьте в каждую лунку 100 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS), содержащего живой/мертвый фиксируемый краситель, который реагирует со свободным амином на белки в течение 10 минут для мечения мертвых клеток.
   3. Приготовьте для каждого образца 30 мкл смеси, содержащей все антитела (анти-CD3. -CD56, TCRγδ во флуорохроме А и анти-CD4, CD8, CD19, CD14 во флуорохроме В). Концентрации антител указаны в таблице 1 и таблице 2. На этой стадии также могут быть добавлены титруемые антитела против различных молекул-мишеней и в различных флуорохромах (например, табл. 3).
      заметка: Концентрация антител может варьироваться в зависимости от производителя и номера партии. Поэтому для достижения оптимального сигнала следует проводить предварительные тесты. PBS, PBS/0,5% бычьего сывороточного альбумина (БСА), PBS/0,2% азида натрия или PBS/0,5% БСА/0,1% азида натрия использовали с аналогичными результатами для разбавления антител. Клетки также могут быть окрашены в объемах, отличных от 30 μл, чтобы легко интегрировать эту методологию в уже существующие протоколы окрашивания.
   4. Центрифугируйте при 350 x g в течение 3 мин при RT и осторожно отсасывайте надосадочную жидкость, не нарушая клеточную гранулу. Добавьте коктейль антител в каждую лунку и осторожно восстановите суспендию, не образуя пузырьков. Инкубировать в течение 30 минут в RT в темноте.
      заметка: С аналогичными результатами можно окрашивать образцы при температуре 4 °C.
   5. Добавьте 150 мкл буфера для окрашивания и центрифугируйте при 350 x g в течение 3 мин при RT и осторожно отаскуйте надосадочную жидкость, не нарушая клеточную гранулу. Ресуспендируйте клетки в 200 мкл PBS и получите данные на проточном цитометре. Если объемы окрашивания изменяются, убедитесь, что исходная смесь антител, используемая для вымывания избытка антител, разбавляется не менее чем в 20 раз.
      заметка: Окрашенные клетки могут быть зафиксированы в PBS/2% параформальдегиде, храниться в холодильнике при температуре 4 °C в течение ночи, а затем получены на проточном цитометре на следующий день><. осторожность: Параформальдегид вреден при проглатывании и может вызвать раздражение кожи

2. Титрование антител

ПРИМЕЧАНИЕ: Титрование антител является наиболее важным этапом для получения высококачественных, воспроизводимых данных. Титрование анти-CD3, -CD8, -CD14, -CD19 и -TCR γδ следует стандартной процедуре, с помощью которой концентрация антител для оптимального разделения положительных и отрицательных пиков определяется по максимальному индексу окрашивания. Следует выбирать разведения на пике или ближе к пику на восходящей стороне кривой индекса окрашивания (Рисунок 1A-C). Анти-CD4-антитело титруют таким образом, чтобы поместить пик CD4-положительной популяции между CD3-одиночными положительными популяциями и CD3⁺/CD8⁺ Т-клетками, ближе к CD3-одиночному положительному сигналу для лучшей дифференциации популяций CD8dim (CD8⁺ γδ Т-клеток и NK Т-клеток). Аналогичным образом, титрование CD56 направлено на позиционирование NK CD56⁺ клеток между популяцией CD3⁺ и CD3^-.

1. Максимальный индекс окрашивания кривая
   Примечание: Титрование анти-CD3, -CD8, -CD14, -CD19 и -TCR γδ следует стандартной процедуре, с помощью которой концентрация антител для оптимального разделения положительных и отрицательных пиков определяется с помощью кривой максимального индекса окрашивания. Если на панель добавляются антитела против других маркеров, их также необходимо титровать с помощью кривой максимального индекса окрашивания.
   1. Приготовьте 2-кратное разведение антител, заполнив 10 лунок 96-луночного планшета 40 мкл окрашивающего буфера. В первой лунке увеличьте конечный объем до 80 мкл окрашивающего буфера и добавьте интересующее антитело в концентрации, в 4 раза превышающей концентрацию, предложенную производителем.
   2. Хорошо перемешайте и перелейте 40 μл во вторую лунку. Хорошо перемешайте и повторите этот шаг для всех остальных лунок.
   3. Окрашивание 10 образцов PBMC или цельной крови 30 мкл из 10 различных 2-кратных разведений антител в соответствии с протоколом, описанным выше.
   4. Соберите данные с помощью проточного цитометра и постройте график сигнала от каждого разведения (рис. 1A).
   5. Затвор на отрицательную и положительную популяции для каждой концентрации антитела. Повышение концентрации антител может привести к более высокому фону. Поэтому измените размер отрицательного элемента соответственно.
   6. Для каждой концентрации антитела извлеките информацию о медиане и стандартном отклонении для интенсивности флуоресценции отрицательной популяции и медиане интенсивности флуоресценции положительной популяции. Рассчитайте для каждой концентрации антитела индекс окрашивания по следующей формуле: (медиана интенсивности флуоресценции положительной популяции — медиана интенсивности флуоресценции отрицательной популяции) ÷ (2 x стандартное отклонение интенсивности флуоресценции отрицательной популяции) (рис. 1B).
   7. Нанесите график зависимости индекса окрашивания от концентрации антитела, выраженной в виде доли разведения антител (например, разведение 1:10 = 0,1), и определите концентрацию антитела с максимальным значением индекса окрашивания (рис. 1C).
2. Титрование антител к -CD4 и -CD56
   Примечание: Титрование антител к -CD4 и -CD56 основано на предыдущем титровании других маркеров на панели из двух флуорохромов. Для антител к CD4 титрование направлено на размещение сигнала анти-CD4 между двойным сигналом CD8⁺/CD3⁺ и популяцией одиночных положительных CD3 (рисунок 1D).
   1. Титруйте антитела к CD4 и CD56 с помощью стратегии двукратного разведения, как описано выше, добавляя дополнительные концентрации между ними, чтобы точно определить диапазон концентраций, который позволяет отделить CD4⁺ Т-клетки и NK-клетки от других клеточных популяций.
   2. Титруйте анти-CD4 антитела, помещая анти-CD4 сигнал между двойным сигналом CD8⁺/CD3⁺ и одинарной положительной популяцией CD3 (рис. 1D).
      заметка: Особое внимание следует уделять четкому отделению CD4⁺ Т-клеток от CD8⁺ тусклых популяций.
   3. Титруйте антитела против CD56 по стратегии, аналогичной титрованию антител к CD4, путем помещения NK-клеток между CD3-негативными и CD3-положительными популяциями.

3. Стратегия стробирования

1. Определите популяции лимфоцитарных и моноцитарных клеток и удалите из анализа мертвые клетки и большую часть остаточных эритроцитов.
   1. Выберите всю популяцию, содержащую лимфоциты и моноциты, на основе прямой и боковой зоны рассеяния (FSC-A против SSC-A). Удалите агрегаты ячеек из анализа с помощью зависимости высоты прямого рассеяния от ширины прямого рассеяния (FSC-H против FSC-W) и высоты бокового рассеяния от ширины бокового рассеяния (SSC-H против SSC-W).
   2. Используйте маркер различения живых/мертвых, чтобы исключить из анализа яркие положительные мертвые клетки и остаточные эритроциты. Гейт на лимфоцитах и моноцитах на основе различных профилей FSC-A и SSC-A.
2. Стратегия семимаркерного гейтирования двухфлуорохромных лимфоцитарных популяций.
   заметка: В пределах CD3-положительной подгруппы CD4⁺, CD8⁺ и γδ Т-клетки могут быть разделены с помощью антител, которые нацелены исключительно на CD4, CD8 и γδ рецептор. Аналогичным образом, в подгруппе CD3-отрицательных В-клетки, NK-клетки и моноциты могут быть однозначно идентифицированы с использованием антител против CD19, CD56 и CD14 соответственно.
   1. Выберите ворота лимфоцитов и создайте точечную диаграмму с одним из двух флуорохромов, используемых в этом протоколе на каждой оси (рис. 2B).
   2. Гейт на CD8⁺ Т-клетках, идентифицированных как CD3⁺/CD8⁺ двойные положительные клетки, в верхнем правом углу точечной диаграммы (рис. 2B). Исключите тусклую популяцию CD8, которая может содержать NKT-клетки. Гейт на CD4⁺ Т-клетках идентифицирован как популяция между CD8⁺ Т-клетками и CD3 одиночными положительными популяциями. Ворота на γδ Т-клетках идентифицированы как клетки с высоким уровнем CD3. Подразделяют γδ Т-клетки на CD8-положительные и CD8-отрицательные.
   3. Ворота на NK-клетках идентифицируются как популяция между CD3-положительными и CD3-отрицательными клетками. Подразделяют NK-клетки на CD8-положительные и CD8-отрицательные. Ворота на В-клетках идентифицированы как CD3-отрицательная популяция CD19⁺ в правом нижнем углу точечной диаграммы.
   4. Выберите моноцитарные вентили и создайте точечную диаграмму с одной из двух флуорохромов, используемых в этом протоколе на каждой оси (рис. 2C). Gate на популяцию CD3^-/CD14⁺.

Таблица 1: Панель антител, используемая для окрашивания двумя флуорохромными иммунными клетками PBMC (комбинация BV421-PE).

цель	клон	Флуорохром	продавец	концентрация	цель
CD3	UCHT1	БВ421	БД	1/20	происхождение
КД56	НКАМ16.2	БВ421	БД	1/900
TCRγδ	В1	БВ421	био	1/30
СД4	РПА-Т4	ПЭ	БД	1/450
СД8	РПА-Т8	ПЭ	БД	1/20
СД14	М5Е2	ПЭ	БД	1/15
СД19	ХИБ19	ПЭ	БД	1/300
Мертвые клетки		Л/Д Синий	ЛТ	1/300	Дискриминация между живым и мертвым
BD = BD Biosciences, Bio = BioLegend, LT = Life Technologies

Таблица 2: Панель антител, используемая для окрашивания иммунных клеток двумя флуорохромами PBMC (КОМБИНАЦИЯ APC-PE).

цель	клон	Флуорохром	продавец	концентрация	цель
CD3	UCHT1	БТР	БД	1/20	происхождение
КД56	НКАМ16.2	БТР	БД	1/60
TCRγδ	В1	БТР	био	1/30
СД4	РПА-Т4	ПЭ	БД	1/450
СД8	РПА-Т8	ПЭ	БД	1/20
СД14	М5Е2	ПЭ	БД	1/15
СД19	ХИБ19	ПЭ	БД	1/300
Мертвые клетки		Л/Д Синий	ЛТ	1/300	Дискриминация между живым и мертвым
BD = BD Biosciences, Bio = BioLegend, LT = Life Technologies

Таблица 3: Панель антител, используемая для окрашивания замороженного PBMC пациента с множественной миеломой.

цель	клон	Флуорохром	каталог	продавец	концентрация	цель
CD3	UCHT1	БВ421	562426	БД	1/20	происхождение
КД56	НКАМ16.2	БВ421	562751	БД	1/900
TCRγδ	В1	БВ421	331217	био	1/30
СД4	РПА-Т4	ПЭ	555347	БД	1/450
СД8	РПА-Т8	ПЭ	555367	БД	1/20
СД14	М5Е2	ПЭ	555398	БД	1/15
СД19	ХИБ19	ПЭ	555413	БД	1/300
ККР7	Г043Н7	АФ647	353217	био	1/30	дифференциация
CD45RA	ХИ100	БТР-Н7	560674	БД	1/60
ККР4	1Г1	ПЭ-CY7	561034	БД	1/60	Th подмножеств
ККР6	Г034-Е3	БВ605	353419	био	1/30
КХКР3	1С6/КХКР3	АФ488	No 561730	БД	1/30
КД57	НК-1	ПЭ-КФ594	562488	БД	1/900	Активация/Истощение
HLA-DR	Г46-6	БВ510	563083	БД	1/30
СД16	3G8	БУВ395	563784	БД	1/30	NK, активация моноцитов
Мертвые клетки		Л/Д Синий	Л-23105	ЛТ	1/300	Дискриминация между живым и мертвым

Результаты

Рисунок 1: Репрезентативное титрование антител. (A) Точечная диаграмма показывает экспрессию CD8 на свежем PBMC, окрашенном указанной концентрацией антитела. (B) В таблице представлены медиана и стандартное отклонение интенсивности флуоресценции CD8+, медиана интенсивности флуоресценции популяции CD8- и производный индекс окрашивания для каждой испытанной концентраци...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
CD3	BD Biosciences	562426	Антитела для окрашивания РРИД: AB_11152082
КД56	BD Biosciences	562751	Антитела для окрашивания РРИД: AB_2732054
TCRgd	BD Biosciences	331217	Антитела для окрашивания РРИД: AB_2562316
СД4	BD Biosciences	555347	Антитела для окрашивания РРИД: AB_395752
СД8	BD Biosciences	555367	Антитела для окрашивания РРИД: AB_395770
СД14	BD Biosciences	555398	Антитела для окрашивания РРИД: AB_395799
СД19	BD Biosciences	555413	Антитела для окрашивания РРИД: AB_395813
CD3	BD Biosciences	555335	Антитела для окрашивания РРИД: AB_398591
КД56	BD Biosciences	555518	Антитела для окрашивания РРИД: AB_398601
TCRgd	BD Biosciences	331211	Антитела для окрашивания РРИД: AB_1089215
ККР7	Биолегенда	353217	Антитела для окрашивания РРИД: AB_10913812
CD45RA	BD Biosciences	560674	Антитела для окрашивания РРИД: AB_1727497
ККР4	BD Biosciences	561034	Антитела для окрашивания РРИД: AB_10563066
ККР6	BD Biosciences	353419	Антитела для окрашивания РРИД: AB_11124539
КХКР3	BD Biosciences	No 561730	Антитела для окрашивания РРИД: AB_10894207
КД57	BD Biosciences	562488	Антитела для окрашивания РРИД: AB_2737625
HLA-DR	BD Biosciences	563083	Антитела для окрашивания РРИД: AB_2737994
СД16	BD Biosciences	563784	Антитела для окрашивания РРИД: AB_2744293
Мертвые клетки	Технологии жизни	Л-23105	Дискриминация живых/мертвых
96-луночная пластина с V-образным днищем	Термофишер	No 249570	пластина для окрашивания
Сортировщик клеток FACSAria IIu	BD Biosciences		Проточный цитометр
ФТС Экспресс 6	Программное обеспечение De Novo		Анализ FACS
Графпад Призма	Программное обеспечение GraphPad		анализ данных