1. Штрих-код лизированных/фиксированных клеток крови
- Медленно размораживайте лизированные/фиксированные образцы клеток из хранилища при температуре -80 °C на льду; максимум 20 образцов могут быть помечены уникальными штрих-кодами и объединены с помощью этой системы. Разбавьте буфер для химической завивки 10X штрих-кодирования в соотношении 1:10 с PBS; сделайте достаточный буфер для ~3 мл на образец.
- Заполните одно нестерильное корыто с помощью CSM и одно с помощью буфера для завивки с штрих-кодированием 1X. Добавьте 1 мл ледяного CSM в только что размороженные образцы, тщательно перемешайте пипеткой и переложите в соответствующие предварительно помеченные полипропиленовые кластерные пробирки.
- Возьмите образец объемом 10 мкл для подсчета клеток с помощью автоматического счетчика клеток или гемоцитометра. Нормализуйте количество клеток до 1,5–2 x 10по 6 клеток на образец в каждой кластерной пробирке: удалите и отбракуйте объем избыточных клеток выше 2 x 106 клеток.
- Центрифугируйте ячейки при 600 x g в течение 5 минут при комнатной температуре. Ресуспендируйте клетки в 1 мл буфера для химической завивки с 1X штрих-кодированием с помощью многоканальной пипетки и центрифуги при 600 x g в течение 5 минут при комнатной температуре. Отсасывайте от надосадочной жидкости.
- Выровняйте кластерные пробирки на штативе в том же порядке, который указан на ключе штрих-кода, чтобы образец совпадал со своим штрих-кодом. Добавляйте 800 мкл 1X буфера для химической завивки с помощью многоканальной пипетки во все образцы в кластерных пробирках, не касаясь клеточной гранулы наконечниками пипетки (не смешивая) для уменьшения потерь клеток. Отложите в сторону штатив с кластерными пробирками.
- Снимите трубки с 20-plex Pd Barcoding Kit от -20 °C и разморозьте при комнатной температуре. Добавьте 100 μL буфера для химической завивки с штрих-кодированием 1X, тщательно перемешайте и перенесите 120 μL ресуспендированной смеси штрих-кодов в соответствующие образцы клеток в кластерных пробирках.
- Тщательно перемешивайте с помощью многоканальной пипетки, чтобы не было перекрестного загрязнения между образцами с индивидуальными штрихкодами. Инкубируйте кластерные пробирки в течение 30 минут при комнатной температуре, чтобы штрих-коды могли маркировать клетки.
- Центрифуга при 600 х г в течение 5 минут при комнатной температуре. Аспирируйте надосадочную жидкость, затем повторно суспендируйте в 1 мл CSM.
- Снова центрифуга и ресуспендия в CSM.
заметка: Теперь каждый образец помечен уникальным штрих-кодом, и образцы готовы к объединению.
- Центрифугируйте при 600 х г в течение 5 минут при комнатной температуре и отаскайте надосадочную жидкость. С помощью одной пипетки и с помощью одного и того же наконечника перенесите все гранулы клеток в остаточном объеме ~70–80 мкл в одну полистирольную пробирку. НЕ выталкивайте наконечник пипетки; Отложите в сторону одну пипетку с этим наконечником.
- С помощью многоканального дозатора и новых наконечников добавьте ~100 μL CSM в каждую исходную кластерную пробирку, чтобы максимизировать восстановление клеток. С помощью одной пипетки с отведенным в сторону наконечником перенесите все гранулы клеток в остаточном объеме ~100 мкл в ту же полистирольную трубку.
- Добавьте CSM, чтобы долить полистирольную трубку (~3 мл). Подсчитайте и запишите номер ячейки объединенного набора штрихкодов. Центрифугируйте при 600 х г в течение 5 минут при комнатной температуре и отаскайте надосадочную жидкость. Приступайте к окрашиванию образцов со штрих-кодом в тот же день.
Примечание: Нормально ожидать потери ~20–30% клеток в процессе штрихкодирования.
2. Окрашивание лизированных/фиксированных клеток крови со штрих-кодом и подготовка к анализу на приборе для масс-цитометрии
Примечание: Каждый титр окрашивающего антитела в 1X (1 мкл антитела на 100 мкл окрашивающей реакции) обычно может окрашивать 3–4 x 106 клеток. Поэтому, когда все образцы со штрихкодами объединяются в одну пробирку, количество антител необходимо увеличивать. Если 20 образцов со штрих-кодом составляют 30 x 106 клеток, и каждый титр 1X может окрашивать 3–4 x 106 клеток, образец со штрих-кодом требует только титров 10X, в отличие от окрашивания каждого образца по отдельности, для которого потребуется 20-кратное количество антител (1X на отдельную пробирку). Концентрацию антитела к числу клеток следует тщательно титровать для каждого отдельного коктейля антител (здесь не обсуждается).
- Окрашивание клеток с помощью антител (Таблица материалов) для поверхностного окрашивания и индукции цитокинов.
- Приготовьте коктейль для окрашивания поверхности, рассчитав количество, которое должно быть добавлено, и учитывая ошибку пипетирования (т.е. при окрашивании 20 образцов со штрих-кодом 2 x 10по 6 клеток в каждом образце, требуется окрашивание титром в 10 раз; для расчета окончательного объема компенсируйте ошибку пипетирования, сделав раствор для окончательного окрашивания в 10,5 раз).
- Добавьте в 10 раз больше объема окрашивания поверхности к грануле ячейки со штрих-кодом. Чтобы уменьшить потерю клеток, с помощью одного и того же наконечника смешайте и отмерьте объем поверхностных красителей и клеточных гранул.
- В зависимости от объема клеток и окрашивающего коктейля добавьте CSM к конечному объему окрашивания 50 мкл на количество образцов клеток (т.е. при работе с набором из 20 образцов 50 мкл X 20 = 1 мл). Инкубировать в течение 30 минут при 4 °C. Перемешивать образец каждые 15 минут, чтобы обеспечить равномерное окрашивание.
- Во время инкубации поверхностных пятен подготовьте буфер Perm/Wash (Таблица материалов), разбавив 1:10 фильтрованным ddH2O. Подготовьте объемы 2 мл для пермеабилизации и 5 мл для стирки. Хранить при температуре 4 °C или на льду.
- Долейте пробирку для окрашивания поверхности с помощью CSM и центрифугируйте при 600 x g при 4 °C в течение 5 мин. Аспирируйте надосадочную жидкость. Суспендируйте образец со штрих-кодом в 2 мл при температуре 4 °C, разбавляя буфер Perm/Wash в соотношении 1:10. Инкубировать при температуре 4 °C в течение 20–30 мин для полного проникновения клеток.
- Центрифугируйте при 600 x g при 4 °C в течение 5 мин и аспирируйте надосадочную жидкость.
- Для внутриклеточного окрашивания следуйте аналогичным шагам окрашивания (как и при поверхностном окрашивании). Тем не менее, используйте буфер Perm/Wash с разбавлением 4 °C, 1:10 вместо CSM, чтобы получить общий объем окрашивания таким образом, чтобы клетки оставались в проникающей среде на протяжении всего внутриклеточного окрашивания.
- Добавьте внутриклеточный коктейль антител в окрашенную и проникнувшую клеточную гранулу на поверхность (шаги 2.1.2–2.1.7). Доведите общий объем окрашивания до 50 мкл на количество образцов клеток. Инкубировать в течение 60 минут при температуре 4 °C. Перемешивать образец каждые 15 минут, чтобы обеспечить равномерное окрашивание.
- Во время внутриклеточного окрашивания готовят раствор интеркалятора: 900 мкл отфильтрованного PBS + 100 μл отфильтрованного 16% PFA (конечная концентрация 1,6% PFA) + 0,2 μл 500 мкМ интеркаляторного красителя (Таблица материалов).
- Добавьте клеточную гранулу + коктейль из внутриклеточных антител с холодным буфером 1:10 Perm/Wash.
- Центрифугируйте при 600 x g при 4 °C в течение 5 мин и отсасывайте надосадочную жидкость. Долейте до тюбика для окрашивания CSM. Посчитайте и запишите номер сотового телефона. Центрифугируйте при 600 x g при 4 °C в течение 5 мин и отсасывайте надосадочную жидкость. Ресуспендируйте клетки в 1 мл раствора интеркалятора, начиная с шага 4.9. Инкубировать не менее 20 минут при комнатной температуре для полной интеркаляции или в течение ночи при 4 °C (образцы в растворе интеркалятора могут оставаться при температуре 4 °C до 1 недели, прежде чем запускать их на приборе для массовой цитометрии).
- Подготовьте клетки для прибора для масс-цитометрии.
- Долейте до пробирки 3 мл отфильтрованного ddH2O и центрифугируйте при 600 x g в течение 5 мин при 4 °C. Повторно суспендируйте клетки в 3 мл отфильтрованного ddH2O. Пропустите эту суспензию через фильтр 100 мкм, чтобы удалить любой мусор или агрегаты, которые потенциально могут засорить прибор для массовой цитометрии.
- Подсчитайте и запишите номер ячейки после фильтрации. Центрифуга при 600 x g в течение 5 мин при 4 °C
- Приготовьте раствор калибровочного валика (Таблица материалов), разбавив его в соотношении 1:10 в отфильтрованном ddH2O.
- Повторно суспендируйте окрашенные клетки в требуемом объеме разбавленного калибровочного раствора гранул 1:10 для достижения концентрации клеток ~1 x 106 клеток/мл.<бр/>
заметка: Для CyTOF1 при концентрации 45 μл/мин рекомендуемый оптимальный показатель составляет 5 x 105 клеток/мл; для Гелиос при 30 μл/мин, 7,5 x 105 якл/мл.
- Приступайте к прогону образца на приборе для масс-цитометрии.
