1. Олигонуклеотидный препарат
- Растворите лигандную цепь дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) в воде (удельное сопротивление 18,2 МОм, используемое на протяжении всего протокола). Сделайте вихрь и раскрутите раствор с помощью настольной центрифуги. Настройте объем воды таким образом, чтобы конечная концентрация составляла 1 мМ. Проверьте концентрацию с помощью нанокапельного спектрофотометра для измерения поглощения при длине волны 260 нм и определите конечную концентрацию на основе коэффициента экстинкции олигонуклеотида.
заметка: Цепь лиганда имеет модификацию на каждом конце, 5'амин и 3'-биотин, для конъюгации с флуорофором и представления биотинилированного лиганда. Аминная группа в цепи лиганда должна быть конъюгирована с флуорофором. Краситель Cy3B используется для этого конъюгации из-за его высокой яркости и фотостабильности, но он обычно не предлагается в продаже и требует собственной конъюгации. Соответственно, в следующем разделе описывается конъюгация между аминами и эфирными красителями на основе N-гидроксисукцинимида (NHS). Для конечных пользователей, у которых нет доступа к оборудованию или ресурсам для модификации нуклеиновых кислот, модифицированные нуклеиновые кислоты могут быть приобретены у специализированных поставщиков для синтеза ДНК, которые предлагают яркие и фотостабильные красители, такие как семейства красителей Alexa и Atto.
- Приготовьте 10 растворов фосфатно-солевого буфера (PBS) и 1 М раствора бикарбоната натрия (NaHCO3). Смешайте 10 мкл раствора 1 мМ амин лиганда (10 нмоль) с 10 мкл 10x PBS, 10 мкл 1 М NaHCO3 и 60 мкл H2O. Растворите 50 г N-гидроксисукцинимида Cy3B (NHS эфир) в 10 мкл диметилсульфоксида (DMSO) непосредственно перед применением и добавьте в смесь общий реакционный объем 100 μл. Добавьте Cy3B NHS эфир последний. Дайте вступить в реакцию при комнатной температуре в течение 1 часа или 4 °C в течение ночи.
- Подготовьте блокирующую цепь Atto647N, конъюгировав аминовую блокирующую цепь с эфиром NHS Atto647N. Приготовьте 10x PBS и 1 М раствор NaHCO3. Смешайте 10 мкл 1 мМ раствора аминной блокирующей нити (10 нмоль) с 10 мкл 10x PBS, 10 мкл 1 М NaHCO3 и 60 мкл H2O. Растворите 50 г эфира NHS Atto647N в 10 мкл ДМСО непосредственно перед применением и добавьте в смесь общий объем реакции 100 мкл. Добавьте эфир NHS Atto647N в последнюю очередь. Дайте вступить в реакцию при комнатной температуре в течение 1 часа или 4 °C в течение ночи.
- После реакции удалите побочные продукты, излишки красителя и соли с помощью фильтрации обессоливающим гелем P2. Разбавьте реакционную смесь H2O до общего объема 300 мкл, который подходит для последующей стадии очистки с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Добавьте 650 μL гидратированного геля P2 в центробежное устройство и вращайте при 18 000 x g в течение 1 минуты. Удалите жидкость с дна устройства, добавьте реакционную смесь в колонку, содержащую гель P2, открутите при 18 000 x g в течение 1 минуты и соберите реакционную смесь на дне устройства.
заметка: Гель P2 следует увлажнить не менее чем за 4 часа до использования с H2O.
- Обессоленную реакционную смесь очистите с помощью ВЭЖХ с использованием колонки С18, предназначенной для очистки олигонуклеотидов, растворителем А: 0,1 М триэтиламмония ацетата (TEAA) в Н,2О и В: ацетонитрил (АЦН) в качестве подвижной фазы для линейного градиентного элюирования 10-100% В течение 50 мин со скоростью потока 0,5 мл/мин. Введите обессоленную реакционную смесь в ВЭЖХ с обратной фазой впрыска объемом 500 мкл для очистки. Соберите продукт, который имеет пик поглощения для дезоксирибонуклеиновой кислоты, ДНК (260 нм) и пик поглощения для флуорофора (560 нм для Cy3B и 647 нм для Atto647N), и высушите их в вакуумном центробежном концентраторе в течение ночи (см. рисунок 1A).
- Восстановите высушенный продукт на основе олигокрасителя в 100 μл воды. Определите концентрацию цепи лиганда Cy3B и блокирующей цепи Atto647N с помощью нанокапельного спектрофотометра. Убедитесь, что соотношение маркировки красителем близко к 1:1. При необходимости при определении концентрации олигонуклеотида сделайте поправку на абсорбцию красителя в 260 нм.
- Валидацию очищенного продукта с помощью матричной лазерной десорбционной ионизационной масс-спектрометрии времени пролета (MALDI-TOF-MS) с использованием 3-гидроксипропиональдегида (3-HPA) в качестве подложки в 50% ACN/H, 2O с 0,1% трифторуксусной кислотой (TFA) и 5 мг/мл цитрата аммония с использованием 0,5 мкл продукта при 1-5 мкМ для подготовки образцов MALDI-TOF-MS. Пример масс-спектра можно найти на рисунке 1B.
- Растворите шпильку и анкерную жилу тушителя в воде и убедитесь, что концентрация исходных растворов составляет от 50 до 100 мкМ.<бр/>
заметка: Прядь шпильки не изменяется и может быть синтезирована непосредственно на заказ у поставщика. Анкерная цепь имеет тиоловую анкерную группу и гаситель BHQ2 и может быть непосредственно синтезирована по индивидуальному заказу от поставщика.
- Аликвотируйте все олигонуклеотиды. Для кратковременного использования и хранения храните эти олигонуклеотиды при температуре 4 °C. Для длительного хранения заморозьте и держите их при температуре -20 °C. К этому моменту все олигонуклеотиды готовы к сборке зонда натяжения ДНК.
заметка: Повторные циклы замораживания-оттаивания не являются проблемой для олигонуклеотидов.
2. Подготовка поверхности
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка субстратов для зондов натяжения ДНК занимает два дня. Зонд натяжения шпильки ДНК будет функционализирован на стеклянных покровных стеклах.
- День 1
- Поместите покровные стекла диаметром 25 мм на решетку из политетрафторэтилена в стакане объемом 50 мл. Каждый стеллаж может вместить до 8 покровных стекол. Промойте покровные стекла, погрузив их в воду три раза.
- Добавьте 40 мл раствора этанола в соотношении 1:1, смешанного с водой, в стакан, содержащий решетку и покровные стекла, и запечатайте стакан парафиновой пленкой.
- Проработайте стакан ультразвуком в течение 15 минут в ультразвуковом очистителе (рабочая частота 35 кГц) для очистки покровных стекол. После обработки ультразвуком слейте жидкость и промойте стакан с решеткой и покровными стеклами в нем водой не менее 6 раз, чтобы удалить остатки органического растворителя.
- Приготовьте свежий раствор пираньи, смешав серную кислоту и перекись водорода в пропорции 3:1. Чтобы приготовить 40 мл раствора пираньи, сначала добавьте 30 мл серной кислоты в чистую 50 мл стакана, а затем медленно добавьте 10 мл перекиси водорода, H2O2. Раствор пираньи будет быстро нагреваться и пузыриться при добавлении H2O2. Аккуратно перемешайте пиранью с помощью конца стеклянной пипетки.
- Затем перенесите стойку, на которой хранятся покровные стекла, к стакану, содержащему аккуратно перемешанный раствор пираньи для травления (Рисунок 2А). Дайте раствору пираньи гидроксилировать и очистите покровные стекла в течение 30 минут при комнатной температуре. После травления пираньи перенесите штатив с помощью стального или политетрафторэтиленового пинцета в чистый стакан объемом 50 мл с водой и снова промойте водой не менее 6 раз><.
осторожность: Большое количество органических веществ может вступать в бурную реакцию с раствором пираньи и вызывать взрыв. Будьте осторожны и всегда работайте с раствором пираньи в вытяжном шкафу. Обязательно наденьте лабораторный халат, перчатки и защитные очки. Никогда не храните свежий раствор пираньи в герметичном контейнере.
заметка: Соотношение перекиси водорода и серной кислоты должно быть не ниже 1:2 (v:v) и никогда не должно превышать 1:1. При погружении стеллажа с покровными стеклами в раствор пираньи помещайте их в раствор медленно и осторожно. Не стоит выбрасывать раствор сразу после травления, так как он еще активен и горячий. Оставьте его в стакане на ночь, прежде чем высыпать в контейнер для кислотных отходов.
- Погрузите штатив с покровными стеклами в стакан объемом 50 мл с этанолом объемом 40 мл, чтобы удалить воду. Выбросьте этанол и повторите 3 раза, чтобы убедиться, что вода была удалена.
- Затем погрузите штатив в 3% аминопропилтриэтоксисилан (APTES) (v/v) в 40 мл этанола для реакции с -OH на покровных стеклах на 1 ч при комнатной температуре (рис. 2B).
заметка: Этанол можно заменить ацетоном.
- Промойте поверхности 6 раз, погрузив их в 40 мл этанола, затем высушите в духовке при температуре 80 °C в течение 20 минут. После охлаждения высушенные аминомодифицированные покровные стекла хранить при температуре -20 °C для дальнейшего использования (до 6 месяцев).
- Застелите нижнюю внутреннюю сторону пластиковой чашки Петри диаметром 10 см парафиновой пленкой. Парафиновая пленка предотвращает скольжение покровных стекол внутри чашки Петри и помогает сохранить раствор для следующих этапов функционализации на покровных стеклах. Поместите остывшие покровные листы, модифицированные амином, в чашки Петри. Сторона, которую необходимо функционализировать, должна быть обращена вверх.
- Чтобы изменить аминные группы на покровных стеклах, добавьте 300 мкл 0,5% массовой липоевой кислоты полиэтиленгликоля (ПЭГ) NHS (LA-PEG-SC) и 2,5% масс mPEG NHS (mPEG-SC) в 0,1 М NaHCO3 на каждую покровную крышку и инкубируйте в течение 1 ч при комнатной температуре (рис. 2C). На каждый покровный стекло толщиной 25 мм нанесите 1,5 мг LA-PEG-SC и 7,5 мг mPEG-SC. Растворяйте реагенты NHS непосредственно перед добавлением их на поверхности, так как они имеют короткий период полураспада (~10 минут) в водном растворе при комнатной температуре. После реакции промойте поверхности 3 раза водой.
заметка: Реакцию NHS можно проводить при температуре 4 °C в течение ночи. Реагенты NHS имеют более длительный период полувыведения перед гидролизом при 4 °C, что составляет около 4-6 часов. В результате потребуется трехдневная процедура подготовки поверхности.
- Добавьте 100 мкл 0,1 М бикарбоната натрия, NaHCO3, содержащего 1 мг/мл ацетата сульфо-NHS, в набор покровных стекол типа «сэндвич» (два покровных стекла, обращенных друг к другу с реакционным буфером между ними). Дайте пассивации произойти не менее 30 минут. Чтобы сохранить реагент, этот этап можно провести с 50 мкл 1 мг/мл ацетата сульфо-NHS. Промойте водой три раза после пассивации.
- Добавьте 0,5 мл наночастиц золота (AuNP, 8,8 нм, дубильная кислота, 0,05 мг/мл) в каждую покровную камеру и инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре (рис. 2D). Чтобы сэкономить реагент, этот шаг можно выполнить, скрепив два покровных стекла. Убедитесь, что в системе нет солей от предыдущих этапов, чтобы избежать скопления наночастиц золота. Не оставляйте покровные стекла сохнуть после этого шага.
- Между тем, предварительно гибридизованные шпилька 4,7 пН, цепь лиганда Cy3B и якорная цепь BHQ2, которые образуют зонды натяжения ДНК, конструируются в соотношении 1,1:1:1 в 1 М хлорида натрия (NaCl) при 300 нМ в пробирке полимеразной цепной реакции (ПЦР). Отжигайте нити, нагревая раствор до 95 °C в течение 5 минут, затем постепенно охлаждайте, снижая температуру до 20 °C в течение 30 минут в термоамплификаторе.
- Промойте покровные стекла водой три раза после 30 минут инкубации с наночастицами золота. Добавьте дополнительную якорную цепь BHQ2 (из 100 мкМ заготовки) в отожженный раствор ДНК, чтобы соотношение между якорной цепью BHQ2 и цепью лиганда Cy3B составило 10:1. На этом этапе раствор ДНК должен содержать 300 нМ конструкции натяжного зонда и 2,7 мкМ цепи BHQ2. Добавьте 100 μL на два покровных стекла, чтобы получился «бутерброд» (Рисунок 2E).
- Осторожно поместите шарик влажной лабораторной салфетки в чашку Петри (вдали от покровных стекол) и запечатайте чашку парафиновой пленкой, чтобы раствор не высох. Накройте посуду фольгой и выдерживайте при температуре 4 °C в течение ночи.
- День 2
- Смойте лишние щупы с покровных стекол с помощью 1x PBS. Проверьте качество поверхности зонда натяжения ДНК под эпифлуоресцентным микроскопом.
- Приготовьте 40 мкг/мл стрептавидина в 1x PBS и инкубируйте на покровных листах в течение 30 минут при комнатной температуре (рис. 2F). Как правило, 100 мкл достаточно для покровного стекла толщиной 25 мм. Промойте PBS 3 раза после инкубации, чтобы смыть избыточное количество стрептавидина.
- Получите 40 мкг/мл биотинилированного антитела/лиганда в 1x PBS. Добавьте 50-100 μL на бутерброд и инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре (Рисунок 2G). Промойте PBS три раза после инкубации, чтобы смыть избыточное количество биотинилированного антитела/лиганда.
- Аккуратно соберите чистые камеры визуализации с поверхностями. Поверхности могут легко трескаться при затягивании камер. Добавьте 0,5-1 мл сбалансированного солевого раствора Хэнка (HBSS) в камеры визуализации и держите их готовыми к визуализации с клетками (рис. 2H).
3. Визуализация сил клеточных рецепторов
- Получить иммунные клетки, представляющие интерес для HBSS, в концентрации 1-2 x 106 клеток/мл.
заметка: В качестве примера в данной работе используются наивные клетки OT-1 CD8+. Очистите наивные Т-клетки OT-1 CD8+ из селезенки умерщвленных мышей с помощью набора для выделения CD8+ Т-клеток мыши MACS с магнитно-активируемым сепаратором сортировки клеток (MACS) в соответствии с инструкциями производителя. Изолируйте и обогащайте CD8+ Т-клетки, удаляя все не-CD8+ Т-клетки, с которыми связывается коктейль антител, разрушающий магниты. Ресуспендируйте очищенные OT-1 CD8+ наивные Т-клетки в HBSS в концентрации 2 x 106 клеток/мл и держите на льду перед использованием.
- Проверьте качество поверхности натяжного зонда ДНК под флуоресцентным микроскопом (объектив 100x) для контроля качества перед добавлением лигандов или покрытием ячеек. Визуализируйте и количественно оцените среднюю интенсивность фона в канале Cy3B поверхности зонда натяжения шпильки ДНК, по крайней мере, из 5 различных положений и 3 повторений. Поддерживайте согласованность условий получения изображений, чтобы это значение можно было использовать в качестве надежного маркера качества поверхности и плотности зонда (рис. 3C).
заметка: Количественно оцените количество нитей ДНК на наночастицу золота и количество наночастиц золота намкм2 в первые несколько раз подготовки поверхности в соответствии с литературой, что может быть использовано в качестве еще одного надежного маркера качества поверхности.
- Пластина ~4 x 104 - 10 x 10 4 клетки на каждый зонд натяжения ДНК функционализирует покровное стекло и позволяет им прикрепиться и распределиться в течение ~15 минут при комнатной температуре.
- По мере того, как клетки наносятся на зонды натяжения шпилек ДНК и начинают распространяться, визуализируйте флуоресцентные сигналы, генерируемые в канале Cy3B, с помощью объектива 100x (рис. 2I).
- После того, как клетки начинают производить сигнал натяжения в реальном времени на поверхности зонда натяжения ДНК в канале Cy3B, получают изображения как в каналах Cy3B, так и в каналах Atto647N (микроскопия полного внутреннего отражения (TIRF) дает лучшее соотношение сигнал/шум, чем эпифлуоресценция). Затем добавьте цепь Atto647N в камеры визуализации в конечной концентрации 200 нМ для механической селективной гибридизации.
- После 10 минут инкубации быстро и аккуратно извлеките буфер, содержащий флуоресцентную блокирующую нить Atto647N, и замените его свежими сбалансированными солями Хэнка. Снова сделайте изображение в обоих каналах Cy3B и Atto647N и определите коэффициент корреляции Пирсона с помощью программного обеспечения Fiji.
- В интересующий момент времени введите нефлуоресцентную блокирующую нить в клетки в камере визуализации для хранения сигнала напряжения. Приготовьте запорный запас (100 μМ) и добавьте в ячейки в конечной концентрации 1 μМ. Аккуратно перемешайте пипеткой. Продолжительность блокировки может варьироваться, но рекомендуемым временем является 10 минут.
- Получение видеороликов с интервальной съемкой или изображений конечных точек в эпифлуоресцентном режиме как для качественного отображения напряжения, так и для количественного анализа по мере необходимости (Рисунок 2J и Рисунок 4).
заметка: Если требуется измерение натяжения в нескольких временных точках, инициируйте стирание сохраненных сигналов натяжения путем добавления разблокирующей нити. Чтобы избежать чрезмерного промывания, используется более высокая конечная концентрация разблокирующей нити на уровне 2 мкМ, чтобы инициировать реакцию смещения нити, опосредованную опосредованной опорой для пальцев ног, с блокирующей нитью в течение 3 минут, которая стирает сохраненные сигналы (рис. 2J). Аккуратно смойте излишки олигонуклеотидов с помощью HBSS. Поверхность зонда натяжения шпильки ДНК и клетки готовы к следующему раунду накопления и картирования напряжения. Разблокировка сигналов напряжения не требуется, если в исследовании представляет интерес только одна временная точка.
