Использование зондов напряжения на основе ДНК для оценки рецепторных сил, прилагаемых иммунными клетками

Аннотация

Источник: Ma, R. et al., Зонды натяжения ДНК для картирования переходных сил рецептора Пиконьютона иммунными клетками. J. Vis. Exp.(2021)

Видео демонстрирует метод оценки рецепторных сил, применяемых иммунными клетками, с использованием наночастиц золота, закрепленных полиэтиленгликолем, и зондов натяжения шпилек ДНК. CD8-положительные взаимодействия с Т-клетками запускают разворачивание зонда, испуская флуоресценцию, в то время как блокирующие нити поддерживают сигнал для количественной оценки сил, прилагаемых иммунными клетками.

Протокол

1. Олигонуклеотидный препарат

1. Растворите лигандную цепь дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) в воде (удельное сопротивление 18,2 МОм, используемое на протяжении всего протокола). Сделайте вихрь и раскрутите раствор с помощью настольной центрифуги. Настройте объем воды таким образом, чтобы конечная концентрация составляла 1 мМ. Проверьте концентрацию с помощью нанокапельного спектрофотометра для измерения поглощения при длине волны 260 нм и определите конечную концентрацию на основе коэффициента экстинкции олигонуклеотида.
   заметка: Цепь лиганда имеет модификацию на каждом конце, 5'амин и 3'-биотин, для конъюгации с флуорофором и представления биотинилированного лиганда. Аминная группа в цепи лиганда должна быть конъюгирована с флуорофором. Краситель Cy3B используется для этого конъюгации из-за его высокой яркости и фотостабильности, но он обычно не предлагается в продаже и требует собственной конъюгации. Соответственно, в следующем разделе описывается конъюгация между аминами и эфирными красителями на основе N-гидроксисукцинимида (NHS). Для конечных пользователей, у которых нет доступа к оборудованию или ресурсам для модификации нуклеиновых кислот, модифицированные нуклеиновые кислоты могут быть приобретены у специализированных поставщиков для синтеза ДНК, которые предлагают яркие и фотостабильные красители, такие как семейства красителей Alexa и Atto.
2. Приготовьте 10 растворов фосфатно-солевого буфера (PBS) и 1 М раствора бикарбоната натрия (NaHCO₃). Смешайте 10 мкл раствора 1 мМ амин лиганда (10 нмоль) с 10 мкл 10x PBS, 10 мкл 1 М NaHCO₃ и 60 мкл H₂O. Растворите 50 г N-гидроксисукцинимида Cy3B (NHS эфир) в 10 мкл диметилсульфоксида (DMSO) непосредственно перед применением и добавьте в смесь общий реакционный объем 100 μл. Добавьте Cy3B NHS эфир последний. Дайте вступить в реакцию при комнатной температуре в течение 1 часа или 4 °C в течение ночи.
3. Подготовьте блокирующую цепь Atto647N, конъюгировав аминовую блокирующую цепь с эфиром NHS Atto647N. Приготовьте 10x PBS и 1 М раствор NaHCO₃. Смешайте 10 мкл 1 мМ раствора аминной блокирующей нити (10 нмоль) с 10 мкл 10x PBS, 10 мкл 1 М NaHCO₃ и 60 мкл H₂O. Растворите 50 г эфира NHS Atto647N в 10 мкл ДМСО непосредственно перед применением и добавьте в смесь общий объем реакции 100 мкл. Добавьте эфир NHS Atto647N в последнюю очередь. Дайте вступить в реакцию при комнатной температуре в течение 1 часа или 4 °C в течение ночи.
4. После реакции удалите побочные продукты, излишки красителя и соли с помощью фильтрации обессоливающим гелем P2. Разбавьте реакционную смесь H₂O до общего объема 300 мкл, который подходит для последующей стадии очистки с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Добавьте 650 μL гидратированного геля P2 в центробежное устройство и вращайте при 18 000 x g в течение 1 минуты. Удалите жидкость с дна устройства, добавьте реакционную смесь в колонку, содержащую гель P2, открутите при 18 000 x g в течение 1 минуты и соберите реакционную смесь на дне устройства.
   заметка: Гель P2 следует увлажнить не менее чем за 4 часа до использования с H₂O.
5. Обессоленную реакционную смесь очистите с помощью ВЭЖХ с использованием колонки С18, предназначенной для очистки олигонуклеотидов, растворителем А: 0,1 М триэтиламмония ацетата (TEAA) в Н,₂О и В: ацетонитрил (АЦН) в качестве подвижной фазы для линейного градиентного элюирования 10-100% В течение 50 мин со скоростью потока 0,5 мл/мин. Введите обессоленную реакционную смесь в ВЭЖХ с обратной фазой впрыска объемом 500 мкл для очистки. Соберите продукт, который имеет пик поглощения для дезоксирибонуклеиновой кислоты, ДНК (260 нм) и пик поглощения для флуорофора (560 нм для Cy3B и 647 нм для Atto647N), и высушите их в вакуумном центробежном концентраторе в течение ночи (см. рисунок 1A).
6. Восстановите высушенный продукт на основе олигокрасителя в 100 μл воды. Определите концентрацию цепи лиганда Cy3B и блокирующей цепи Atto647N с помощью нанокапельного спектрофотометра. Убедитесь, что соотношение маркировки красителем близко к 1:1. При необходимости при определении концентрации олигонуклеотида сделайте поправку на абсорбцию красителя в 260 нм.
7. Валидацию очищенного продукта с помощью матричной лазерной десорбционной ионизационной масс-спектрометрии времени пролета (MALDI-TOF-MS) с использованием 3-гидроксипропиональдегида (3-HPA) в качестве подложки в 50% ACN/H_{, 2}O с 0,1% трифторуксусной кислотой (TFA) и 5 мг/мл цитрата аммония с использованием 0,5 мкл продукта при 1-5 мкМ для подготовки образцов MALDI-TOF-MS. Пример масс-спектра можно найти на рисунке 1B.
8. Растворите шпильку и анкерную жилу тушителя в воде и убедитесь, что концентрация исходных растворов составляет от 50 до 100 мкМ.<бр/> заметка: Прядь шпильки не изменяется и может быть синтезирована непосредственно на заказ у поставщика. Анкерная цепь имеет тиоловую анкерную группу и гаситель BHQ2 и может быть непосредственно синтезирована по индивидуальному заказу от поставщика.
9. Аликвотируйте все олигонуклеотиды. Для кратковременного использования и хранения храните эти олигонуклеотиды при температуре 4 °C. Для длительного хранения заморозьте и держите их при температуре -20 °C. К этому моменту все олигонуклеотиды готовы к сборке зонда натяжения ДНК.
   заметка: Повторные циклы замораживания-оттаивания не являются проблемой для олигонуклеотидов.

2. Подготовка поверхности

ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка субстратов для зондов натяжения ДНК занимает два дня. Зонд натяжения шпильки ДНК будет функционализирован на стеклянных покровных стеклах.

1. День 1
   1. Поместите покровные стекла диаметром 25 мм на решетку из политетрафторэтилена в стакане объемом 50 мл. Каждый стеллаж может вместить до 8 покровных стекол. Промойте покровные стекла, погрузив их в воду три раза.
   2. Добавьте 40 мл раствора этанола в соотношении 1:1, смешанного с водой, в стакан, содержащий решетку и покровные стекла, и запечатайте стакан парафиновой пленкой.
   3. Проработайте стакан ультразвуком в течение 15 минут в ультразвуковом очистителе (рабочая частота 35 кГц) для очистки покровных стекол. После обработки ультразвуком слейте жидкость и промойте стакан с решеткой и покровными стеклами в нем водой не менее 6 раз, чтобы удалить остатки органического растворителя.
   4. Приготовьте свежий раствор пираньи, смешав серную кислоту и перекись водорода в пропорции 3:1. Чтобы приготовить 40 мл раствора пираньи, сначала добавьте 30 мл серной кислоты в чистую 50 мл стакана, а затем медленно добавьте 10 мл перекиси водорода, H₂O₂. Раствор пираньи будет быстро нагреваться и пузыриться при добавлении H₂O₂. Аккуратно перемешайте пиранью с помощью конца стеклянной пипетки.
   5. Затем перенесите стойку, на которой хранятся покровные стекла, к стакану, содержащему аккуратно перемешанный раствор пираньи для травления (Рисунок 2А). Дайте раствору пираньи гидроксилировать и очистите покровные стекла в течение 30 минут при комнатной температуре. После травления пираньи перенесите штатив с помощью стального или политетрафторэтиленового пинцета в чистый стакан объемом 50 мл с водой и снова промойте водой не менее 6 раз><. осторожность: Большое количество органических веществ может вступать в бурную реакцию с раствором пираньи и вызывать взрыв. Будьте осторожны и всегда работайте с раствором пираньи в вытяжном шкафу. Обязательно наденьте лабораторный халат, перчатки и защитные очки. Никогда не храните свежий раствор пираньи в герметичном контейнере.
      заметка: Соотношение перекиси водорода и серной кислоты должно быть не ниже 1:2 (v:v) и никогда не должно превышать 1:1. При погружении стеллажа с покровными стеклами в раствор пираньи помещайте их в раствор медленно и осторожно. Не стоит выбрасывать раствор сразу после травления, так как он еще активен и горячий. Оставьте его в стакане на ночь, прежде чем высыпать в контейнер для кислотных отходов.
   6. Погрузите штатив с покровными стеклами в стакан объемом 50 мл с этанолом объемом 40 мл, чтобы удалить воду. Выбросьте этанол и повторите 3 раза, чтобы убедиться, что вода была удалена.
   7. Затем погрузите штатив в 3% аминопропилтриэтоксисилан (APTES) (v/v) в 40 мл этанола для реакции с -OH на покровных стеклах на 1 ч при комнатной температуре (рис. 2B).
      заметка: Этанол можно заменить ацетоном.
   8. Промойте поверхности 6 раз, погрузив их в 40 мл этанола, затем высушите в духовке при температуре 80 °C в течение 20 минут. После охлаждения высушенные аминомодифицированные покровные стекла хранить при температуре -20 °C для дальнейшего использования (до 6 месяцев).
   9. Застелите нижнюю внутреннюю сторону пластиковой чашки Петри диаметром 10 см парафиновой пленкой. Парафиновая пленка предотвращает скольжение покровных стекол внутри чашки Петри и помогает сохранить раствор для следующих этапов функционализации на покровных стеклах. Поместите остывшие покровные листы, модифицированные амином, в чашки Петри. Сторона, которую необходимо функционализировать, должна быть обращена вверх.
   10. Чтобы изменить аминные группы на покровных стеклах, добавьте 300 мкл 0,5% массовой липоевой кислоты полиэтиленгликоля (ПЭГ) NHS (LA-PEG-SC) и 2,5% масс mPEG NHS (mPEG-SC) в 0,1 М NaHCO₃ на каждую покровную крышку и инкубируйте в течение 1 ч при комнатной температуре (рис. 2C). На каждый покровный стекло толщиной 25 мм нанесите 1,5 мг LA-PEG-SC и 7,5 мг mPEG-SC. Растворяйте реагенты NHS непосредственно перед добавлением их на поверхности, так как они имеют короткий период полураспада (~10 минут) в водном растворе при комнатной температуре. После реакции промойте поверхности 3 раза водой.
       заметка: Реакцию NHS можно проводить при температуре 4 °C в течение ночи. Реагенты NHS имеют более длительный период полувыведения перед гидролизом при 4 °C, что составляет около 4-6 часов. В результате потребуется трехдневная процедура подготовки поверхности.
   11. Добавьте 100 мкл 0,1 М бикарбоната натрия, NaHCO₃, содержащего 1 мг/мл ацетата сульфо-NHS, в набор покровных стекол типа «сэндвич» (два покровных стекла, обращенных друг к другу с реакционным буфером между ними). Дайте пассивации произойти не менее 30 минут. Чтобы сохранить реагент, этот этап можно провести с 50 мкл 1 мг/мл ацетата сульфо-NHS. Промойте водой три раза после пассивации.
   12. Добавьте 0,5 мл наночастиц золота (AuNP, 8,8 нм, дубильная кислота, 0,05 мг/мл) в каждую покровную камеру и инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре (рис. 2D). Чтобы сэкономить реагент, этот шаг можно выполнить, скрепив два покровных стекла. Убедитесь, что в системе нет солей от предыдущих этапов, чтобы избежать скопления наночастиц золота. Не оставляйте покровные стекла сохнуть после этого шага.
   13. Между тем, предварительно гибридизованные шпилька 4,7 пН, цепь лиганда Cy3B и якорная цепь BHQ2, которые образуют зонды натяжения ДНК, конструируются в соотношении 1,1:1:1 в 1 М хлорида натрия (NaCl) при 300 нМ в пробирке полимеразной цепной реакции (ПЦР). Отжигайте нити, нагревая раствор до 95 °C в течение 5 минут, затем постепенно охлаждайте, снижая температуру до 20 °C в течение 30 минут в термоамплификаторе.
   14. Промойте покровные стекла водой три раза после 30 минут инкубации с наночастицами золота. Добавьте дополнительную якорную цепь BHQ2 (из 100 мкМ заготовки) в отожженный раствор ДНК, чтобы соотношение между якорной цепью BHQ2 и цепью лиганда Cy3B составило 10:1. На этом этапе раствор ДНК должен содержать 300 нМ конструкции натяжного зонда и 2,7 мкМ цепи BHQ2. Добавьте 100 μL на два покровных стекла, чтобы получился «бутерброд» (Рисунок 2E).
   15. Осторожно поместите шарик влажной лабораторной салфетки в чашку Петри (вдали от покровных стекол) и запечатайте чашку парафиновой пленкой, чтобы раствор не высох. Накройте посуду фольгой и выдерживайте при температуре 4 °C в течение ночи.
2. День 2
   1. Смойте лишние щупы с покровных стекол с помощью 1x PBS. Проверьте качество поверхности зонда натяжения ДНК под эпифлуоресцентным микроскопом.
   2. Приготовьте 40 мкг/мл стрептавидина в 1x PBS и инкубируйте на покровных листах в течение 30 минут при комнатной температуре (рис. 2F). Как правило, 100 мкл достаточно для покровного стекла толщиной 25 мм. Промойте PBS 3 раза после инкубации, чтобы смыть избыточное количество стрептавидина.
   3. Получите 40 мкг/мл биотинилированного антитела/лиганда в 1x PBS. Добавьте 50-100 μL на бутерброд и инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре (Рисунок 2G). Промойте PBS три раза после инкубации, чтобы смыть избыточное количество биотинилированного антитела/лиганда.
   4. Аккуратно соберите чистые камеры визуализации с поверхностями. Поверхности могут легко трескаться при затягивании камер. Добавьте 0,5-1 мл сбалансированного солевого раствора Хэнка (HBSS) в камеры визуализации и держите их готовыми к визуализации с клетками (рис. 2H).

3. Визуализация сил клеточных рецепторов

1. Получить иммунные клетки, представляющие интерес для HBSS, в концентрации 1-2 x 10⁶ клеток/мл.
   заметка: В качестве примера в данной работе используются наивные клетки OT-1 CD8+. Очистите наивные Т-клетки OT-1 CD8⁺ из селезенки умерщвленных мышей с помощью набора для выделения CD8⁺ Т-клеток мыши MACS с магнитно-активируемым сепаратором сортировки клеток (MACS) в соответствии с инструкциями производителя. Изолируйте и обогащайте CD8⁺ Т-клетки, удаляя все не-CD8+ Т-клетки, с которыми связывается коктейль антител, разрушающий магниты. Ресуспендируйте очищенные OT-1 CD8+ наивные Т-клетки в HBSS в концентрации 2 x 10⁶ клеток/мл и держите на льду перед использованием.
2. Проверьте качество поверхности натяжного зонда ДНК под флуоресцентным микроскопом (объектив 100x) для контроля качества перед добавлением лигандов или покрытием ячеек. Визуализируйте и количественно оцените среднюю интенсивность фона в канале Cy3B поверхности зонда натяжения шпильки ДНК, по крайней мере, из 5 различных положений и 3 повторений. Поддерживайте согласованность условий получения изображений, чтобы это значение можно было использовать в качестве надежного маркера качества поверхности и плотности зонда (рис. 3C).
   заметка: Количественно оцените количество нитей ДНК на наночастицу золота и количество наночастиц золота на^мкм2 в первые несколько раз подготовки поверхности в соответствии с литературой, что может быть использовано в качестве еще одного надежного маркера качества поверхности.
3. Пластина ~4 x 10⁴ - 10 x 10 4 клетки на каждый зонд натяжения ДНК функционализирует покровное стекло и позволяет им прикрепиться и распределиться в течение ~15 минут при комнатной температуре.
4. По мере того, как клетки наносятся на зонды натяжения шпилек ДНК и начинают распространяться, визуализируйте флуоресцентные сигналы, генерируемые в канале Cy3B, с помощью объектива 100x (рис. 2I).
5. После того, как клетки начинают производить сигнал натяжения в реальном времени на поверхности зонда натяжения ДНК в канале Cy3B, получают изображения как в каналах Cy3B, так и в каналах Atto647N (микроскопия полного внутреннего отражения (TIRF) дает лучшее соотношение сигнал/шум, чем эпифлуоресценция). Затем добавьте цепь Atto647N в камеры визуализации в конечной концентрации 200 нМ для механической селективной гибридизации.
6. После 10 минут инкубации быстро и аккуратно извлеките буфер, содержащий флуоресцентную блокирующую нить Atto647N, и замените его свежими сбалансированными солями Хэнка. Снова сделайте изображение в обоих каналах Cy3B и Atto647N и определите коэффициент корреляции Пирсона с помощью программного обеспечения Fiji.
7. В интересующий момент времени введите нефлуоресцентную блокирующую нить в клетки в камере визуализации для хранения сигнала напряжения. Приготовьте запорный запас (100 μМ) и добавьте в ячейки в конечной концентрации 1 μМ. Аккуратно перемешайте пипеткой. Продолжительность блокировки может варьироваться, но рекомендуемым временем является 10 минут.
8. Получение видеороликов с интервальной съемкой или изображений конечных точек в эпифлуоресцентном режиме как для качественного отображения напряжения, так и для количественного анализа по мере необходимости (Рисунок 2J и Рисунок 4).
   заметка: Если требуется измерение натяжения в нескольких временных точках, инициируйте стирание сохраненных сигналов натяжения путем добавления разблокирующей нити. Чтобы избежать чрезмерного промывания, используется более высокая конечная концентрация разблокирующей нити на уровне 2 мкМ, чтобы инициировать реакцию смещения нити, опосредованную опосредованной опорой для пальцев ног, с блокирующей нитью в течение 3 минут, которая стирает сохраненные сигналы (рис. 2J). Аккуратно смойте излишки олигонуклеотидов с помощью HBSS. Поверхность зонда натяжения шпильки ДНК и клетки готовы к следующему раунду накопления и картирования напряжения. Разблокировка сигналов напряжения не требуется, если в исследовании представляет интерес только одна временная точка.

Результаты

Рисунок 1: Примеры получения олигонуклеотидов.(А) ВЭЖХ-хроматограмма очистки цепи лиганда Cy3B; (B) спектры MALDI-TOF-MS продукта; (В) Таблица расчетной массы и найденных m/z пиков исходного материала и меченого олигонуклеотида.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
3-гидроксипиколиновая кислота (3-ГПА)	сигма	No 56197	Матрица Maldi-TOF-MS
Система mPEG-SC	Биохимпег	MF001023-2К	Подготовка поверхности
(3-аминопропил)триэтоксисилан	Акрос	AC430941000	Подготовка поверхности
10x Буфер для лизиса эритроцитов	Биолегенда	00-4333-57 (Английский)	буфер
Наночастицы золота 8,8 нм, дубильная кислота	Нанокомпосикс	Индивидуальный заказ	Подготовка поверхности
Эфир NHS Atto647N	сигма	18373-1МГ-Ф	Флуорофор, олиго препарат
Камера для клеток Attofluor, для микроскопии	Thermo Fisher Scientific	А7816	отображение
Шприцы BD только с Luer-Lok	BD бионаука	309657	Клетки
Биотинилированный антимышиный CD3e	ebioscience	Тел.: 13-0031-82	Антитела/лиганды
Биотинилированный овальбумин pMHC (SIINFEKL)	Основная установка NIH Tetramer в Университете Эмори	NA	Антитела/лиганды
Бычий сывороточный альбумин	сигма	735078001	Блокировка неспецифических взаимодействий
Сетчатые фильтры для клеток	Биология	15-1100	Клетки
Мини-стойка Coverslip, тефлон	Thermo Fisher Scientific	С14784	Подготовка поверхности
Cy3B NHS эфир	GE Healthcare	PA63101	Флуорофор, олиго препарат
Фосфатно-солевой буфер Дульбекко (DPBS)	Корнинг	21-031-СМ	буфер
этанол	сигма	459836	Подготовка поверхности
Сбалансированные соли Хэнка (HBSS)	сигма	Н8264	буфер
перекись водорода	сигма	Н1009	Подготовка поверхности
ЛА-ПЭГ-СК	Биохимпег	HE039023-3,4 тыс.	Подготовка поверхности
Пусковой комплект Midi MACS (LS)	Милтеньи Биотек	Тел.: 130-042-301	Клетки
Набор для выделения CD8+ Т-клеток мыши	Милтеньи Биотек	Тел.: 130-104-075	Клетки
Центробежные аппараты Nanosep MF	Лаборатория Пэлла	ODM02C35	Подготовка олиго
No 2 круглые стеклянные покровные накладки	ВВР	48382-085	Подготовка поверхности
НТА-ЗРК	Молекулярные технологии Додзиндо	Н475-10	Подготовка поверхности
Гель P2	Био-рад	1504118	Подготовка олиго
серная кислота	Корпорация EMD Millipore	СХ1244-6	Подготовка поверхности
Сульфо-NHS ацетат	Thermo Fisher Scientific	No 26777	Подготовка поверхности
оборудование
Колонка Agilent AdvanceBio Oligonucleotide C18, 4,6 x 150 мм, 2,7 μм	653950-702		Препарат олигонуклеотид
Система очистки воды Barnstead Nanopure	Термо Фишер		Вода
CFI Apo 100× NA 1.49 цель	Компания Nikon		микроскопия
Куб Cy5	Цветность		микроскопия
Устройство с умножительной зарядовой связью электронов (EMCCD) Evolve	Фотометрия		микроскопия
Высокоэффективная жидкостная хроматография	Agilent 1100		Препарат олигонуклеотид
Источник интенсивной эпифлуоресценции	Компания Nikon		микроскопия
Времяпролетный масс-спектрометр с матричной лазерной десорбцией/ионизацией (MALDI-TOF-MS)	Вояджер СТР		Препарат олигонуклеотид
Nanodrop 2000 УФ-ВИД спектрофотометр	Термо Фишер		Препарат олигонуклеотид
Инвертированный микроскоп Nikon Eclipse Ti	Компания Nikon		микроскопия
Идеальная система фокусировки Nikon	Компания Nikon		микроскопия
Программное обеспечение NIS Elements	Компания Nikon		микроскопия
Четырехдиапазонный TIRF 405/488/561/647 куб	Цветность		микроскопия
Куб RICM	Цветность		микроскопия
Пусковая установка TIRF с длиной волны 488 нм (50 мВт), 561 нм (50 мВт) и 640 нм	когерентный		микроскопия
Куб TRITC	Цветность		микроскопия
Имя Oligo	5' модификация / 3' модификация	Последовательность (от 5' до 3')	использование
15мерная аминовая стопорная прядь	5' модификация: без модификации 3' модификация: /3AmMO/	AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TA	Сигнал натяжения блокировки в режиме реального времени
15mer Atto647N стопорная прядь	5' модификация: Atto647N 3' модификация: /3AmMO/	AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TA	Сигнал натяжения блокировки в режиме реального времени
15мерная нефлуоресцентная блокирующая нить	5' модификация: без модификации Модификация 3': без модификаций	A AAA AAC ATT TAT AC	Блокировка сигнала натяжения в режиме реального времени для количественного анализа
Шпилька 4,7 пН	5' модификация: без модификации Модификация 3': без модификаций	GTGAAAATACCGCACAGATGCGT TTGTATAAATGTTTTTTTTTCATTTAT ACTTTAAGAGCGCCACGTAGCC CAGC	Щуп для шпильки
Цепь аминового лиганда	5' модификация: /5AmMC6/ 3' модификация: /3Bio/	CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT	Щуп для шпильки
Анкерная прядь BHQ2	5' модификация: /5ThiolMC6-D/ 3' модификация: /3BHQ_2/	TTTGCTGGGCTACGTGGCGCTT	Щуп для шпильки
Цепь лиганда Cy3B	5' модификация: Cy3B 3' модификация: /3Bio/	CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT	Щуп для шпильки
Разблокировка пряди	5' модификация: без модификации Модификация 3': без модификаций	TAG GTA GGG TAT AAA TGT TTT TTT C	Разблокировка сигнала накопленного натяжения