Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Подготовка и хранение запасов CFSE
- Приготовьте 5 мМ запас 5- и 6-карбоксифлуоресцеина диацетата сукцинимидилового эфира (CFSE) в диметилсульфоксиде. Вихрь. Распределите по 100 мкл аликвот в стерильные микропробирки с завинчивающейся крышкой объемом 0,5 мл. Хранить аликвоты при температуре -80 °C.
2. Мыши
- Используйте инбредных самцов или самок мышей в возрасте от 8 до 12 недель. Предпочтение отдается животным, соответствующим полу и возрасту. Перед началом экспериментов убедитесь, что у животных есть необходимые этические разрешения.
3. Иммобилизация животных с помощью газовой анестезии изофлураном
- Загрузите в наркозный аппарат изофлуран. Наполните газонепроницаемый стеклянный шприц объемом 10 мл изофлураном. Избегайте попадания пузырьков воздуха. Подсоедините шприц и входное отверстие для жидкости к прилагаемой трубке и перемещайте толкатель вперед до тех пор, пока жидкость в соединительной трубке не станет заметной для входа в испаритель.
заметка: Не храните изофлуран в шприце, когда он не используется.
- Обезболивают животных изофлураном в индукционной камере, при этом расход воздуха поддерживается на уровне примерно 400 - 500 мл/мин и концентрация изофлурана на уровне 3,5%.<бр/>
заметка: Агрегат не будет работать без потока воздуха.
- Как только животные уснут, поверните запорный кран на анестезиологическом блоке, чтобы направить газ изофлуран к части маски. Убедитесь, что часть маски не повреждена, чтобы избежать утечки газа. Расход воздуха может поддерживаться на уровне 400 мл/мин, либо уменьшаться до 200 мл/мин. Снизить концентрацию изофлурана до 2,6%.
заметка: Обезболивающий эффект может быть увеличен и/или уменьшен путем регулировки скорости потока.
4. Инъекции и восстановление БЦЖ
- Визуально подтвердите и проведите такие тесты, как тест на рефлекс защемления пальцев ног, чтобы убедиться, что мыши обездвижены/спят на части изофлурановой маски перед выполнением инъекций.
- Ввести в заднюю подушечку лапы 1 x 106 колониеобразующих единиц Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Guérin (BCG) в 30 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS) с помощью шприца, оснащенного иглой 29 G x 1/2 дюйма><.
заметка: Образование микобактериальных запасов кратко описано в первоначальном описании этой процедуры, а также в других местах. БЦЖ также легко доступна из коммерческих источников. Авторы рекомендуют проводить пульсовую обработку ультразвуком или пропускать через шприц для разрушения комков перед их инокуляцией мышам. БЦЖ повторяется здесь в качестве микробного стимула, учитывая его использование в первоначальном описании этого протокола3, но авторы, безусловно, рекомендуют тестировать другие микробные стимулы.
- Выполните ту же процедуру, описанную выше, для введения PBS контрольным мышам.
- Наблюдайте за животными после инъекций, чтобы убедиться, что восстановление после анестезии прошло успешно и что животные могут опираться на инъекционную заднюю подушечку лапы.
5. Инъекции CFSE
- Подготовка CFSE для инъекций
- Разморозьте флакон со стоковым раствором CFSE 5 мМ при температуре до -80 °C. Разбавьте CFSE в PBS в 10 раз. Тщательно суспендируйте раствор перед наполнением шприца при подготовке к инъекции.
- Впрыск и извлечение CFSE
- Повторите процедуру обезболивания животных в разделе 3. Введите 20 мкл 0,5 мМ CFSE в заднюю подушечку лапы, которая ранее получала БЦЖ или PBS.
заметка: Инъекция CFSE должна быть выполнена за день (24 часа) до запланированной даты жертвоприношения.
6. Хирургическое удаление подколенного лимфатического узла (pLN)
ПРИМЕЧАНИЕ: Использование стерилизованных хирургических инструментов и их повторное обеззараживание в 70% этаноле рекомендуется на протяжении всего этого этапа.
- Усыпьте мышей. Опрыскайте животное 70% этанолом. Приколите животное в спинном положении, на доске для вскрытия.
заметка: Авторы могут рекомендовать эвтаназию через вывих шейки матки.
- Аккуратно сделайте вертикальный разрез на заднем бедре. Очистите мышцы и жир с помощью ножниц и пинцета, чтобы обнажить и, следовательно, иссечь pLN, расположенный глубоко в жировом мешочке, во впадине колена.
- Перенесите pLN в 0,5 мл стерильного PBS на лед.
7. Генерация суспензии одиночных клеток из pLN
- Гомогенизируйте pLN через 70-микронный клеточный фильтр, помещенный в 6-луночный планшет, содержащий 5 мл PBS или буфер для сортировки флуоресцентно-активируемых клеток (FACS) (PBS, содержащий 2% эмбриональной телячьей сыворотки (FCS), 5 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) и 1 мМ азида натрия). Гомогенизируйте через ситечко с помощью задней части шприца объемом 3 мл.
заметка: Азид натрия токсичен, и с ним следует обращаться с осторожностью.
- Промойте сетчатое фильтр еще 5 мл PBS или FACS буфером, соберите материал в пробирку объемом 15 мл и гранулируйте элементы при 277 x g (1 200 об/мин, R = 172 мм) в течение 5 мин, 4 °C. В качестве альтернативы гомогенизируйте pLN непосредственно в микроцентрифужных пробирках с помощью полипропиленовых гомогенизаторов.
- В зависимости от размера гранул ресуспендируйте суспензию pLN в соответствующий объем буфера PBS или FACS, например, 200 - 1000 мкл. Используйте счетную камеру для количественного определения общего количества клеток, полученного из каждой суспензии LN. Используйте трипановый синий, чтобы исключить мертвые/умирающие клетки.
8. Окрашивание клеток и проточная цитометрия
- Перенесите 1 - 10 x 106 клеток в полистирольные пробирки с круглым дном объемом 5 мл. Промыть с помощью буфера FACS и гранулы центрифугировать при температуре 277 x g (1 200 об/мин, R= 172 мм) в течение 5 минут, 4 °C.
- Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу в 50 - 100 мкл коктейля антител (см. Маркеры дендритных клеток [DC], используемые для окрашивания поверхности, Таблица материалов), содержащего 0,5 - 1 мкг антимышиного CD16/CD32 (для блокирования неспецифических Fc-опосредованных взаимодействий) в буфере FACS на 30 - 45 мин на льду. Защищайте образцы от света.
- После инкубации промойте клетки с буфером FACS и гранулами центрифугированием при 277 x g (1 200 об/мин, R = 172 мм) в течение 5 мин, 4 °C.
- Ресуспендируйте клетки в 50 - 100 мкл буфера FACS. Получение данных с проточного цитометра.
