Все процедуры с участием людей были выполнены в соответствии с институциональными, национальными и международными рекомендациями по благополучию человека и были рассмотрены местным институциональным наблюдательным советом.
1. Культура и условия A. fumigatus
- Приготовьте минимальную для глюкозы агаровую среду, как описано.
- Отрегулируйте среду до pH 6,5 с помощью 1 М гидроксида натрия (NaOH) и отоставьте в автоклаве при 120 °C в течение 20 минут.
- Дайте остыть до 65 °C.
- Работая в стерильном проточном колпаке, налейте 30 мл охлажденной среды в колбу T75 и дайте ей остыть, положив горлышко колбы на пипетку объемом 25 мл, чтобы создать наклон агара.
- Выделите штамм dsRed Af293-Aspergillus fumigatus на агар и инкубируйте в течение 7 дней при 37 °C + 5% углекислого газа (CO2). Из двух колб получится примерно 109 конидий в 5 мл фосфатно-солевого буфера (PBS) до биотинилирования.
2. Маркировка и приготовление A. fumigatus
ПРИМЕЧАНИЕ: При первом выполнении этого анализа подготовьте родительский штамм Af293-A. fumigatus. Возьмите образцы обоих штаммов в микроцентрифужных пробирках и пометьте только один штамм каждого штамма, как описано ниже. Это позволит иметь контрольные конидии без цвета и конидии с одним цветом, либо dsRed, либо Alexa Fluor 633 (AF633), для тестирования установки и оборудования.
- Урожай A. fumigatus conidia путем погружения культуры в 30 мл PBS + 0,05% Твин-80. Полученную суспензию отфильтровать через клеточное сетчатое фильтр 40 мкм в пробирку объемом 50 мл для удаления фрагментов гиф.
- Центрифугируйте при 805 х г в течение 10 минут, удалите надосадочную жидкость и промойте один раз в 20 мл стерильного PBS. Бассейн конидий из двух пластин одного штамма на этапе промывки.
- После этапа промывки повторно суспендируйте гранулу в 5 мл PBS и переложите 1 мл конидиальной суспензии в микроцентрифужные пробирки. Обычно достаточно 1 мл суспензии каждого штамма для визуализации живых клеток. Заверните оставшиеся аликвоты в фольгу и храните при температуре 4 °C.
- Центрифугируйте аликвоты конидиальной суспензии при давлении 9300 х г в течение 10 мин при комнатной температуре и тщательно удалите надосадочную жидкость. Ресуспендируйте конидиальную гранулу в 1 мл 0,05 М бикарбоната натрия (NaHCO3) pH 8,3.
- Приготовьте 10 мг биотина/200 мкл диметилсульфоксида (ДМСО), восстановив 25 мг биотина в 500 мкл ДМСО. Добавьте 10 мкл стокового раствора биотина/ДМСО в микроцентрифужную пробирку, накройте ее алюминиевой фольгой и выдерживайте в течение 2 ч на коромысле при 4 °C.
- Аликвотировать остаток исходного раствора биотина/ДМСО и заморозить при -20 °C для использования в последующих экспериментах.
- Центрифугируйте в течение 10 минут при давлении 9 300 x g и осторожно удалите надосадочную жидкость. Ресуспендируйте конидиальную таблетку в 1 мл 100 мМ трис (гидроксиметил) аминометан-гидрохлорида (Трис-HCl) pH 8,0 в течение 1 ч для дезактивации свободно плавающего биотина.
- Центрифугируйте в течение 10 минут при давлении 9 300 x g и осторожно удалите надосадочную жидкость. Дважды промойте гранулу 1 мл стерильного PBS и повторно суспендируйте гранулу в 1 мл PBS.
- Растворите 1 мг стрептавидина-AF633 в 0,5 мл PBS до получения исходного раствора 2 мг/мл. Добавьте 10 мкл стрептавидина-AF633 2 мг/мл на 1 мл конидиальной суспензии и инкубируйте в течение 40 мин при комнатной температуре на коромысле, покрытом алюминиевой фольгой. Оставшийся стрептавидин-AF633 может быть заморожен в аликвотах для использования в последующих экспериментах.
- Центрифугируйте в течение 10 минут при температуре 9 300 x g и осторожно удалите надосадочную жидкость. Повторно суспендируйте конидиальную гранулу в 1 мл PBS и подсчитайте конидии с помощью гемоцитометра в соотношении 1:1000 (1:100, а затем 1:10). Отрегулируйте кондиальную концентрацию до 3,6 x 106/мл с помощьюCO2-независимого фильтрующего материала, заверните в фольгу и храните при температуре 4 °C.
заметка: Конидии теперь имеют маркировку AF633 и будут называться FLuorescent Aspergillus REporter (FLARE) conidia.
- Дополнительно: Если требуется стимуляция набухшими конидиями, после подсчета конидий (шаг 2.9) разведите конидии до 7,2 x 106/мл в среде дрожжевого азота (YNB) и добавьте 500 мкл конидиальной суспензии к среде YNB объемом 4,5 мл в автоклавной колбе Эрленмейера объемом 50 мл. Накройте крышкой и поместите колбу в встряхивающий инкубатор (200 об/мин при 37 °C) на 6 часов.
- Переложите среду в пробирку объемом 15 мл. Центрифугируйте при 805 х г в течение 10 минут при комнатной температуре и промойте один раз в PBS. Снова центрифугируйте и ресуспендируйте гранулу в 1 млCO2 независимой среды, получив 3,6 x 106 конидий/мл.<бр/>
ПРИМЕЧАНИЕ: Конидии часто слипаются после того, как они набухают, что затрудняет точный подсчет, рекомендуется подсчитывать с использованием подсчитанного количества конидий в состоянии покоя.
3. Выделение нейтрофилов и моноцитов человека
- Возьмите 20 мл венозной крови здоровых добровольцев в две пробирки по 10 мл крови, содержащие этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА). Для каждого донора отдельно налейте 20 мл крови в пробирку объемом 50 мл и разведите до 15 мл PBS.
- Подложите кровь 15 мл раствора для выделения лимфоцитов (плотность 1,077 г/мл) с помощью шприца и железной иглы. Поместите иглу на дно пробирки и осторожно выдавите раствор для выделения лимфоцитов. Центрифуга при давлении 630 x g в течение 20 мин без тормоза и с низким ускорением.
- Приготовьте PBS, охлажденный на льду. <бр/>
заметка: Шаги 3.4 и 3.5 должны выполняться одновременно для получения моноцитов (3.4) и нейтрофилов (3.5).
- С помощью пастетки соберите слой мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC). Это слой в центре между желтой сывороткой (верхний) и прозрачным слоем раствора для выделения лимфоцитов (нижний), и перенесенный в свежую пробирку объемом 50 мл.
- Заполните пробирку с PBMC до 50 мл холодным PBS и центрифугируйте при 582 х г в течение 10 мин. Удалите надосадочную жидкость и дважды промойте холодной PBS и повторно суспендируйте в 1 мл PBS на 20 мл донорской крови, использованной изначально.
- Делайте разведения 1:10 для подсчета, добавляя 20 мкл клеточной суспензии к 160 мкл PBS и 20 мкл трипанового синего. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра.
- Приготовьте буферный раствор, добавив 26 мл термоинактивированной эмбриональной сыворотки теленка (FCS) и 2,1 мл 0,5 М ЭДТА в 500 мл сбалансированного солевого раствора Хэнка (HBSS). Центрифугируйте клетки в течение 10 мин при 515 x g и повторно суспендируйте в 40 мкл буферного раствора на 1 x 107 клеток.
- Переложите клеточную суспензию в пробирку объемом 15 мл и добавьте 10 мкл микрогранул CD14 на 1 x 107 клеток, хорошо перемешайте и инкубируйте в течение 15 минут при 4 °C, перемешивая пробирки каждые 5 минут.
- Промойте ячейки, добавив 1 мл буферного раствора на 1 x 107 клеток, и центрифугируйте при 515 x g в течение 10 минут.
- Полностью асасировать надосадочную жидкость и ресуспендировать до 1 x 108 клеток в 500 мкл буферного раствора.
- Поместите 1 колонку на образец на магнитный сепаратор в соответствии с инструкциями производителя. Сначала один раз промойте колонку 500 μл буферного раствора.
- Пропустите пипеткой 500 мкл клеточной суспензии через колонку, дождитесь высыхания колонки, а затем промойте, повторив это три раза с буферным раствором.
- Поместите новую трубку объемом 15 мл под колонку и снимите колонку с магнитного сепаратора. Затем промойте клетки из колонки в пробирку 1 мл буферного раствора.
- Добавьте 4 мл буферного раствора и центрифугируйте при 515 x g в течение 10 минут, а затем повторно суспендируйте в 1 мл среды Мемориального института Розуэлл Парк (RPMI).
- Делайте разведения 1:10 для подсчета, добавляя 20 мкл клеточной суспензии к 160 мкл PBS и 20 мкл трипанового синего. Посчитайте клетки с помощью гемоцитометра.
- Отрегулируйте концентрацию клеток до 6 x 105/мл с помощью RPMI и затравите 200 μл на стеклянную чашку для визуализации диаметром 35 мм. Инкубировать в течение ночи при 37 °C с 5%CO2.
- На следующий день, перед визуализацией, снимите RPMI и добавьте 200 μL CO2-независимой среды.
заметка: Эти моноциты также могут быть дифференцированы в различные субпопуляции макрофагов до получения визуализации. Если этот метод стоит изучить, то отличной отправной точкой является недавняя статья Охрадановой-Репик и др.
- После сбора слоя PBMC удалите всю сыворотку и большую часть раствора для выделения лимфоцитов, но будьте осторожны, чтобы не удалить маленькую белую полосу на верхней части красной гранулы, так как она будет содержать большую часть нейтрофилов.
- Приготовьте 10-кратный буферный запас для гипотонического лизиса, добавив 83 г хлорида аммония (NH4Cl) и 10 г бикарбоната калия (KHCO3) в 1 л стерильной воды. Хранить при температуре 4 °C.
- Разведите этот бульон в 10 раз стерильной водой и добавьте его в трубки. Затем осторожно переверните 3 раза и выиграйте во льду в течение 15 минут.
- Центрифугируйте при давлении 394 x g в течение 10 мин и повторно суспендируйте в буфере для гипотонического лизиса в течение 10 мин во льду.
- Центрифугируйте при 394 х г и дважды промойте холодной PBS. Ресуспендируйте в 1 млCO2-независимой среды на каждого донора.
- Делайте разведения 1:10 для подсчета, добавляя 20 мкл клеточной суспензии к 160 мкл PBS и 20 мкл трипанового синего. Посчитайте клетки с помощью гемоцитометра.
- Для микроскопии добавьте 200 мкл той же клеточной суспензии в 35-миллиметровую стеклянную чашку для визуализации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Визуализация нейтрофилов или проточная цитометрия должны быть начаты немедленно из-за их склонности к апоптозу, если их не стимулировать. Если это невозможно, нейтрофилы следует держать на льду и использовать как можно скорее (в течение того же дня).
4. Видеомикроскопия живых клеток
ПРИМЕЧАНИЕ: Выбор микроскопа будет зависеть от того, что доступно локально, но конфигурация микроскопа должна включать в себя инвертированный столик, климатическую камеру, нагретую до 37 °C, и соответствующие фильтры возбуждения/излучения для dsRed (532/561 нм) и AF633 (633 нм). Конидии FLARE не работают с лазером 488 нм вместо лазера 532/561 нм для dsRed. При первом выполнении этого эксперимента используйте контрольные конидии без цвета и с одним цветом для проверки фоновой флуоресценции и просвечивания между каналами dsRed и AF633.
- Перед экспериментом включите нагреватель микроскопа и дайте достаточно времени, чтобы камера контроля окружающей среды нагрелась до 37 °C. Время, необходимое для стабилизации температуры камеры, зависит от конфигурации микроскопа.
- Включите микроскоп и компьютер и загрузите программное обеспечение для обработки изображений. Установите чашку для визуализации на предметный столик микроскопа и отрегулируйте фокус, чтобы найти нейтрофилы или моноциты человека.
- Для dsRed и AF633 установите мощность лазера на 10% и время экспозиции на 1 с в настройках захвата.
- Снимите предметное стекло и добавьте 100 мкл конидиальной суспензии 3 x 106/мл FLARE в соответствующие лунки (общий объем 300 мкл/лунка). Запишите время, когда конидии FLARE добавляются в блюдо.
- Верните слайд в рабочую область и отрегулируйте чувствительность камеры для dsRed и AF633, чтобы четко видеть конидии, но не переэкспонировать изображение. Настройте список точек этапа, если требуется многоточечное получение.
- Начните визуализацию, когда все точки находятся в фокусе, каналы оптимизированы, а время и продолжительность цикла заданы. Время цикла и продолжительность визуализации зависят от экспериментального вопроса. Цель состоит в том, чтобы сделать время цикла как можно короче (≤2 минуты) и составлять 1 минуту, что позволяет проводить глубокий анализ динамики поглощения.
