Оценка противогрибковой активности первичных иммунных клеток человека в режиме реального времени

Аннотация

Источник: Brunel, S. F. et al., Живая визуализация противогрибковой активности первичных нейтрофилов и моноцитов человека в ответ на A. fumigatus.J. Vis. Exp. (2017)

Это видео демонстрирует визуализацию живых клеток для анализа противогрибковой активности нейтрофилов человека с использованием флуоресцентных репортеров Aspergillus conidia. Первоначально в нейтрофилах обнаруживается как красная, так и пурпурная флуоресценция, в то время как красная флуоресценция со временем уменьшается, что указывает на деградацию конидий и подтверждает противогрибковую активность нейтрофилов.

Протокол

Все процедуры с участием людей были выполнены в соответствии с институциональными, национальными и международными рекомендациями по благополучию человека и были рассмотрены местным институциональным наблюдательным советом.

1. Культура и условия A. fumigatus

1. Приготовьте минимальную для глюкозы агаровую среду, как описано.
   1. Отрегулируйте среду до pH 6,5 с помощью 1 М гидроксида натрия (NaOH) и отоставьте в автоклаве при 120 °C в течение 20 минут.
   2. Дайте остыть до 65 °C.
   3. Работая в стерильном проточном колпаке, налейте 30 мл охлажденной среды в колбу T75 и ....

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
глицерин	сигма	Г6279	http://www.sigmaaldrich.com
Колба Т75	Greiner Bio-One	Тел.: 658 175	http://www.greinerbioone.com/
ПБС	Gibco	20012-019	https://www.thermofisher.com/
Твин-80	Научный центр Фишера	10592955	https://nl.fishersci.com/
Фильтр 40 μм	Thermo Fisher Scientific	22363547	https://www.thermofisher.com/
Туба Falcon 15 мл	Greiner Bio-One	Телефон: 188 261	http://www.greinerbioone.com/
Туба Falcon 50 мл	Greiner Bio-One	Телефон: 227 261	http://www.greinerbioone.com/
MilliQ	Многородность	QGARD00R1	Наночистая вода работает аналогично. http://www.merckmillipore.com/
биотин	Молекулярные зонды	Б-6352	https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/molecular-probes.html
Дмсо	сигма	Д5879	http://www.sigmaaldrich.com
Стрептавидин-AF633	Молекулярные зонды	С-21375	AF633 является единственным на сегодняшний день протестированным флуорофором, который остается видимым в фагосомах. https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/molecular-probes.html
Пробирки с кровью ЭДТА	Greiner Bio-One	455036	Любые кровяные пробирки с антисвертывающим средством должны работать. http://www.greinerbioone.com/en/start/
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440-03	http://www3.gehealthcare.com/
Трипан синий	Thermo Fisher Scientific	SV3008401	https://www.thermofisher.com/
HBSS	Gibco	14170112	https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/gibco.html
Микрогранулы CD14	Myltenyi Biotec	Тел.: 130-050-201	Можно использовать и другие методы выделения моноцитов, но мы отдаем предпочтение этому методу, так как он обеспечивает стабильно высокую чистоту моноцитов без трудоемкости. http://www.miltenyibiotec.com/en/
Колонны MS	Myltenyi Biotec	Тел.: 130-042-201	Смотрите комментарий на CD14 microbeads. http://www.miltenyibiotec.com/en/
RPMI + глутамакс	Gibco	72400-021	https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/gibco.html
CO2-независимая среда	Thermo Fisher Scientific	18045054	Необходим, если во время визуализации отсутствует достаточный обмен СО2. https://www.thermofisher.com/uk/en/home
μ-образное 8-луночное стеклянное дно	Там же	80827	Это чашка для визуализации, которую мы используем, однако любая стеклянная чашка для визуализации подходящего размера должна подойти. http://ibidi.com/
Система визуализации живых клеток UltraVIEW VoX 3D	Перкин Элмер	L7267000	Включает в себя программное обеспечение volocity для сбора и анализа. http://www.perkinelmer.com/

гг.