Использование липидных бислоев, поддерживаемых шариками, для исследования синаптического выхода Т-клеток

Аннотация

Источник: Céspedes, P. F., et al. Получение липидных бислоев, поддерживаемых шариками, для изучения выхода частиц иммунных синапсов Т-клеток. J. Vis. Exp. (2022)

Это видео иллюстрирует воссоздание синтетических антигенпрезентирующих клеток с помощью липидных бислоев, поддерживаемых шариками, и их применение для оценки синаптического выхода, генерируемого активированными Т-клетками.

Протокол

1. Калибровка плотности белка на BSLB (липидных бислоях с опорой на шарики)

1. Перед тем как взять нефункционализированные гранулы кремнезема диаметром 5,00 ±0,05 мкм, хорошо перемешайте исходный раствор и снова суспензируйте большие комки бусин, осевшие на дне колб.<бр /> ПРИМЕЧАНИЕ: Гранулы диоксида кремния имеют тенденцию быстро оседать, что может привести к ошибкам подсчета. Энергично перемешивайте, пипетируя вверх и вниз до половины максимального объема микропипетки P1000.
2. Разведите 1 мкл раствора шариков в 1000 μл PBS, подсчитайте шарики с помощью камеры гемоцитометра и рассчитайте их концентрацию на мл<бр/>....

Результаты

Рисунок 1: Абсолютное количественное определение белков на поверхности АПК. (A) Пример количественного измерения ICAM-1 методом проточной цитометрии на поверхности В-клеток миндалины (Foll. Bc) и хелперные Т-клетки (TFH). (I-vii) Стратегия стробирования для анализа отдельных CXCR5+ Bc и TFH, выделенных из небных миндалин человека. Показана стратегия последовательного.......

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
96 Well Cell Cultture Plate, U-образное дно с крышкой, обработанная культура тканей, непирогенная	Костар®	No 3799	Для окрашивания FCM и совместного культивирования BSLB и клеток.
96 Well Cell Cultture Plate, V-образное дно с крышкой, обработанная культура тканей, безпирогенная.	Костар®	No 3894	Для FCM окрашивание клеток или шариков в суспензию.
Alexa Fluor 488 NHS Ester (сукцинимидиловый эфир)	Thermo Fisher Scientific, Инвитроген™	А20000
Alexa Fluor 647 NHS Ester (сукцинимидиловый эфир)	Thermo Fisher Scientific, Инвитроген™	А37573 и А20006
Multiwell 6 лунок Культура тканей, обработанная вакуумной газовой плазмой	сокол	353046	Для культивирования и размножения очищенных CD4+ и CD8+ Т-клеток.
Казеин из коровьего молока, подходит в качестве субстрата для протеинкиназы (после дефосфорилирования), очищенный порошок
Dynabeads Т-активатор человека CD3/ CD28	ThermoFisher Scientific, Gibco	11132Д
ДинаМаг-2	ThermoFisher Scientific, Инвитроген™	12321Д	Для удаления Dynabeads Т-активатор человека CD3/CD28 в объемах менее 2 мл
ДинаМаг-15™	ThermoFisher Scientific, Инвитроген™	12301Д	Для удаления Dynabeads™ Т-активатор человека CD3/CD28 в объемах менее 15 мл
Фетальная бычья сыворотка квалифицирована, один шо	ThermoFisher Scientific, Gibco	A3160801	Требуется инактивация тепла на 30 минут при 56 °C
античеловеческий CD154 (CD40L), клон 24-31	Биолегенда	310815 и 310818	Конъюгаты Alexa Fluor 488 и Alexa Fluor 647 соответственно
Армянский хомяк IgG Alexa Fluor 647 Контроль изотипа, клон HTK888	Биолегенда	400902	Маркирован внутри компании с помощью Alexa Fluor 647 NHS Ester (сукцинимидиловый эфир)
Настройка и отслеживание бусин цитометра BD	Бектон Дикинсон и компания (BD)	641319	Отслеживание производительности приборов до количественного FCM