Использование липидных бислоев, поддерживаемых шариками, для исследования синаптического выхода Т-клеток

Аннотация

Источник: Céspedes, P. F., et al. Получение липидных бислоев, поддерживаемых шариками, для изучения выхода частиц иммунных синапсов Т-клеток. J. Vis. Exp. (2022)

Это видео иллюстрирует воссоздание синтетических антигенпрезентирующих клеток с помощью липидных бислоев, поддерживаемых шариками, и их применение для оценки синаптического выхода, генерируемого активированными Т-клетками.

Протокол

1. Калибровка плотности белка на BSLB (липидных бислоях с опорой на шарики)

1. Перед тем как взять нефункционализированные гранулы кремнезема диаметром 5,00 ±0,05 мкм, хорошо перемешайте исходный раствор и снова суспензируйте большие комки бусин, осевшие на дне колб.<бр /> ПРИМЕЧАНИЕ: Гранулы диоксида кремния имеют тенденцию быстро оседать, что может привести к ошибкам подсчета. Энергично перемешивайте, пипетируя вверх и вниз до половины максимального объема микропипетки P1000.
2. Разведите 1 мкл раствора шариков в 1000 μл PBS, подсчитайте шарики с помощью камеры гемоцитометра и рассчитайте их концентрацию на мл<бр/> заметка: Окрашивание трипановым синим цветом не нужно для визуализации гранул кремнезема.
3. Рассчитайте объем гранул кремнезема, необходимый для 5 × 10 5 конечных BSLB на точку титрования.
4. Переложите необходимый объем гранул диоксида кремния в стерильную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
5. Промойте гранулы диоксида кремния три раза 1 мл стерильного PBS и центрифугируйте гранулы в течение 15 с на настольной микроцентрифуге при температуре RT (при фиксированных оборотах).
   ПРИМЕЧАНИЕ: При удалении моющего раствора не тревожьте гранулу шарика. Небольшая буферная колонка не влияет на распространение липосом, составляющих мастер-смесь липосом, поскольку они также находятся в PBS.
6. Приготовьте три объема мастер-смеси липосом, чтобы собрать BSLB на промытых гранулах диоксида кремния (например, если исходный общий объем гранул диоксида кремния составляет 20 мкл, приготовьте минимум 60 мкл мастер-смеси липосом).
7. Для титрования Biotinyl Cap PE в молольном %
   1. Приготовьте липидные мастер-смеси, содержащие 5-кратные разведения Biotinyl Cap PE.
      1. Разбавьте 0,4 мМ Biotinyl Cap PE mol% в 100% DOPC матрице.
      2. Смешайте каждую точку титрования Biotinyl Cap PE в соотношении 1:1 (объем: объем) с раствором 0,4 мМ 25% DGS-NTA(Ni) таким образом, чтобы при всех титрованиях присутствовали последние 12,5 мольные % Ni-содержащих липидов.
         заметка: 12,5 мол.% (объем:об.%) Ni-содержащих липидов представляют собой смешанный липидный состав BSLB, на которых белки, меченные His, также могут быть протестированы в параллельной калибровке. Например, поскольку все запасы липосом получают при одной и той же молярной концентрации, для достижения целевой мольной % смеси в 200 мкл окончательной смеси липосом, просто смешайте 100 мкл 25 моль% Ni-содержащего DGS-NTA со 100 мкл 100 моль% DOPC.
   2. Перенесите 5 × 10⁵ промытых шариков диоксида кремния в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл так, чтобы на каждую пробирку была собрана одна точка титрования Biotinyl Cap PE mol%.
   3. Добавьте мастер-смеси Biotinyl Cap PE для титрования mol% в промытые гранулы диоксида кремния и аккуратно перемешайте пипетированием вверх и вниз до половины общего объема. Следует избегать образования пузырьков, которые в избытке разрушают липидный бислой.
   4. Добавьте газообразный аргон (или азот) на трубку, содержащую образующиеся BSLB, чтобы вытеснить воздух и защитить липиды от окисления во время смешивания.
   5. Добавьте аргон к липидным запасам 0,4 мМ перед хранением и обрабатывайте стерильным методом.
      заметка: Подсоедините небольшую трубку к баллону с газообразным аргоном/азотом. Перед добавлением газа в трубки отрегулируйте регулятор газового баллона так, чтобы давление было установлено не выше 2 фунтов на квадратный дюйм. Подсоедините стерильный наконечник для пипетки к выпускной трубке, чтобы направить поток газа внутрь запаса липосом, в течение 5 секунд и быстро закройте крышку. В случае липидных запасов перед хранением при температуре 4 °C крышку пробирки запечатать парафиновой пленкой.
   6. Переместите BSLB в вертикальный лабораторный смеситель с переменным углом наклона (см. Таблицу материалов) и перемешивайте в течение 30 минут при RT, используя орбитальное перемешивание со скоростью 10 об/мин.
      заметка: Этот шаг предотвратит осаждение гранул во время формирования поддерживаемого липидного бислоя.
   7. Открутите шарики, центрифугируя в течение 15 с в RT на настольной миницентрифуге, а затем трижды промойте 1 мл HBS/HSA (BSA), чтобы удалить излишки липосом.
   8. Блокируйте образовавшиеся BSLB, добавляя 1 мл 5% казеина или 5% BSA, содержащих 100 мкМ NiSO₄ для насыщения сайтов NTA и 200 нМ стрептавидина для равномерного покрытия всех биотин-якорных сайтов на BSLB. Осторожно перемешайте, пипетируя вверх и вниз половину общего объема, и инкубируйте в вертикальном смесителе не более 20 минут при RT и 10 об/мин.
   9. Открутите BSLB путем центрифугирования в течение 15 с в RT на настольной миницентрифуге, а затем трижды промойте 1 мл буфера HBS/HSA (BSA).
      заметка: Держите вымытые бусины вертикально с небольшим объемом буфера для стирки, покрывающим BSLB. Избегайте обезвоживания BSLB, так как воздух разрушает липидный бислой.
8. Для титрования меченых His-меченных белков на 12,5 мол.% DGS-(Ni)NTA-содержащих BSLB
   1. Приготовьте три объема мастер-смеси липосом, содержащих последние 12,5 мол.% DGS-NTA(Ni).
   2. Используйте мастер-смесь для липосом, чтобы суспендировать промытые гранулы диоксида кремния, и аккуратно перемешайте, пипетируя вверх и вниз половину общего объема. Избегайте образования пузырьков, которые в избытке повреждают липидный бислой.
   3. Добавьте газообразный аргон (или азот) на трубку, содержащую образующиеся BSLB, чтобы вытеснить воздух и защитить липиды от окисления во время смешивания.
   4. Добавьте аргон к 0,4 мМ липидным запасам перед хранением и обрабатывайте с помощью стерильной техники.
   5. Переместите BSLB в вертикальный смеситель и перемешивайте в течение 30 минут при RT с помощью орбитального перемешивания со скоростью 10 об/мин.
   6. Открутите шарики, центрифугируя в течение 15 с в RT на настольной миницентрифуге, а затем трижды промойте 1 мл HBS/HSA (BSA), чтобы удалить излишки липосом.
   7. Заблокируйте образовавшиеся BSLB, добавив 1 мл 5% казеина (или 5% BSA), содержащего 100 μM NiSO4, для насыщения сайтов NTA на BSLB. Осторожно перемешайте и инкубируйте в вертикальном смесителе не более 20 минут при RT и 10 об/мин.
   8. Трижды вымойте с помощью HBS/HSA (BSA), чтобы удалить излишки блокирующего раствора.
   9. В новой 96-луночной пластине U-образного дна готовят 2-кратные серийные разведения белков.
      1. Приготовьте начальную концентрацию 100 нМ для интересующего белка в общем объеме 200 мкл буфера HBS/HSA (BSA), распределите 100 мкл этого раствора в первой колонке, а оставшиеся 100 мкл в верхней части колонки #2, содержащей 100 мкл буфера HBS/HSA (BSA).
      2. Продолжайте последовательным переносом 100 мкл из столбца #2 в столбец #3 и повторяйте по мере необходимости, чтобы охватить все точки титрования. Оставьте последний столбец ряда без белка, так как он будет использоваться в качестве пустого эталона для количественной оценки.
   10. Ресуспендируйте приготовленные BSLB в объеме, таком, чтобы 5 × 10⁵ BSLB содержались в 100 мкл буфера HBS/HSA (BSA).
   11. Перекачиваем 100 мкл суспензии BSLB в лунки второго U-образного дна 96-луночной пластины таким образом, чтобы каждая скважина получала 5 × 10⁵ BSLB.
   12. Опустите вторую тарелку, содержащую BSLB, в течение 2 минут при 300 × g и RT и выбросьте надосадочную жидкость.
   13. Переложите объемы объемом 100 мкл с планшета для титрования белка на планшет, содержащий осажденные BSLB. Осторожно перемешайте, не допуская образования избыточных пузырьков во время пипетирования, и инкубируйте в течение 30 минут при RT и 1 000 об/мин с помощью планшетного шейкера. Защитите от света алюминиевой фольгой.
   14. Трижды промойте пластину буфером HBS/HSA (BSA) с использованием ступеней отстаивания 300 × г в течение 2 минут при RT.
   15. Если рекомбинантный белок, используемый в калибровке, непосредственно конъюгирован с флуорохромами и имеет известные значения F/P.
   16. Если рекомбинантный белок, используемый в калибровке, не меченый или конъюгированный с флуорохромами или стандарт MESF недоступен, используйте Alexa Fluor 488 или 647-конъюгированные антитела с известными значениями F/P для окрашивания BSLB, покрытого белком.
   17. Окрашивание насыщающими концентрациями антител количественного определения.
       ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от целевого уровня экспрессии, они колеблются от 5 до 10 мкг/мл.
   18. Окрашивайте в течение 30 минут при температуре RT и 1 000 об/мин с помощью встряхивателя для пластин. Защитите от света с помощью алюминиевой фольги.
   19. Дважды промыть буфером HBS/HSA (BSA) и один раз PBS с использованием стадий осаждения 300 × г в течение 2 минут при RT.
       заметка: Используйте PBS, pH 7,4 для ресуспендирования промытых BSLB перед получением. Не используйте буферы, содержащие белок, так как это приводит к образованию пузырьков при автоматическом смешивании образцов с высокопроизводительными пробоотборниками.
   20. Получите стандарты MESF, убедившись, что самые яркие пики остаются в диапазоне линейного детектирования для детектора (канала) количественного определения, как показано на рисунке 1B (vii).
   21. Соберите образцы вручную или с помощью HTS. При использовании последнего ресуспендируйте BSLB в 100 μл PBS и получите 80 μL с расходом от 2,5 до 3,0 μл/с, объемом смешивания 100 μл (или 50% от общего объема, если объем ресуспензии меньше), скоростью смешивания 150 μл/с и пятью смесями для обеспечения монодисперсности BSLB.
   22. Экспортируйте файлы FCS.
   23. Сосредоточьтесь на одиночных событиях для анализа (рис. 2A), так как дублеты или триплеты приведут к ошибкам при определении. Используйте вложенную идентификацию отдельных событий, как указано на шаге протокола 1.2.3.
   24. Измерьте MFI каждой фракции MESF (1-4) и вычтите MFI чистых бусин, чтобы извлечь скорректированные MFI (cMFI).
   25. Выполните линейный регрессионный анализ для извлечения наклона (b) MESF над cMFI, рассчитанным для стандартов MESP.
   26. Извлеките MFI каждой точки титрования и вычтите MFI гранул без белка, чтобы получить cMFI.
   27. Разделите cMFI на вычисленный наклон, чтобы извлечь привязку MESF к BSLB для каждой точки титрования.
   28. Разделите MESF, связанный с BSLBs, на значение F/P антитела количественного определения для извлечения среднего числа молекул, связанных на BSLB.
   29. Используя диаметр BSLB (5,00 ± 0,05 мкм), извлеките площадь поверхности шарика (SA = 4pr2) для расчета конечной плотности белка (моль/^мкм2) на точку титрования (концентрация белка).
   30. Проведите новый регрессионный анализ зависимости концентрации белка от плотности белка для расчета наклона (b) линии наилучшего соответствия.
       заметка: Концентрация 12,5 мол.% DGS-NTA(Ni) обеспечивает максимальную якорную способность около 10 000 моль/мкм2 10, не вызывая неспецифической активации Т-клеток и не влияя на латеральную подвижность SLB.

2. Проведение экспериментов по синаптическому переносу между Т-клетками и BSLB

1. Перед запуском эксперимента по синаптическому переносу
   1. Приобретите нефлуоресцентные BSLB, BSLB с флуоресцентными липидами, неокрашенные элементы (или компенсационные шарики; см. Таблицу материалов) и одноцветные окрашенные элементы (или компенсационные шарики) для идентификации флуоресцентных спектральных взаимодействий прибора. Сосредоточьтесь на детекторах с высоким распространением побочных эффектов, чтобы изменить конструкцию полихроматической панели, повысить чувствительность и уменьшить погрешность измерений на критически важных детекторах.
   2. Титруйте антитела для обнаружения для определения оптимальной концентрации, что позволяет обнаруживать положительные события без ущерба для обнаружения отрицательных результатов.
      заметка: Повторяйте этот шаг всякий раз, когда происходит изменение партии антител, так как значения F/P и яркость меняются от партии к партии.
   3. Опционально: Оптимизируйте напряжения ФЭУ путем получения образца в различных диапазонах напряжения (т.е. при отклонении напряжения) для поиска ФЭУ, ведущих к оптимальному сигналу по шуму (т.е. разделение отрицательных и положительных сигналов при одновременном сохранении сигнала самой яркой популяции в линейном диапазоне).
2. Измерение переноса выходного сигнала Т-элемента в BSLB
   1. Готовят добавку RPMI 1640 (здесь и среда R10), содержащую 10% инактивированной при нагревании фетальной бычьей сыворотки (FBS), 100 мкМ заменимых аминокислот, 10 мМ HEPES, 2 мМ L-глутамина, 1 мМ пирувата натрия, 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Используйте среду R10 для культивирования и расширения Т-клеток.
   2. В 1-й день изолируйте Т-клетки из периферической крови или камер лейкорудукционной системы (LRS). Используйте наборы для выделения и разделения клеток иммуноплотности (см. Таблицу материалов) для обогащения CD4+ и CD8+ Т-клеток человека.
   3. Затравливайте клетки в конечной концентрации в диапазоне от 1,5 до 2,0 × 10⁶ клеток/мл, используя 6-луночные планшеты с общим содержанием не более 5 мл на лунку.
   4. Активируйте Т-клетки с помощью магнитных гранул активации Т-клеток человека (анти-CD3/анти-CD28) в соотношении 1:1 (см. Таблицу материалов) и добавьте 100 МЕ рекомбинантного человеческого IL-2 для поддержки пролиферации и выживания клеток.
   5. На 3 день удалите активирующие магнитные шарики с помощью магнитных столбиков (см. Таблицу материалов). Убедитесь, что магнитные шарики остаются прикрепленными к боковым сторонам трубки, прежде чем извлекать элементы для дополнительных этапов промывки.
   6. Промойте магнитные шарики еще раз 5 мл свежей среды R10, хорошо перемешайте и положите их обратно в магнит. Восстановите этот объем и смешайте его с клетками, восстановленными на шаге 1.2.5.
   7. Ресуспендируйте клетки до 1,5-2 × 10⁶ клеток/мл в свежем R10, содержащем 100 Ед/мл IL-2. Пополняют среду через 48 ч, следя за тем, чтобы последнее добавление ИЛ-2 было за 48 ч до дня эксперимента (с 7 по 14 день посева).
   8. В день эксперимента по синаптическому переносу приготовьте среду для анализа синаптического переноса, добавив среду RPMI 1640 без фенола красного 10% FBS, 100 мкМ заменимых аминокислот, 2 мМ L-глутамина, 1 мМ пирувата натрия, 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Не включайте рекомбинантный человеческий IL-2.
   9. Подсчитайте элементы с помощью окрашивания трипановым синим или исключения электрического тока и ресуспендируйте их до конечной концентрации 2,5 × 10⁶ клеток/мл в среде. Если наблюдается чрезмерная гибель клеток (>10%), удалите мертвые/отмирающие клетки с помощью смеси полисахарида и диатризоата натрия (см. Таблицу материалов) следующим образом:
      1. Слой 15 мл клеточной культуры поверх 13 мл раствора полисахарид-диатризоата натрия.
      2. Центрифуга на 1 250 × g в течение 20 мин при RT с минимальными ускорениями и разгонами. Соберите клеточный слой (облако) на границе раздела между средой и раствором полисахарид-диатризоата натрия.
      3. Промойте клетки не менее двух раз предварительно подогретой средой для анализа синаптического переноса (приготовленной на шаге 1.2.7).
      4. Подсчитайте и ресуспендируйте клетки до конечной концентрации 2,5 × 10⁶/мл с использованием среды для анализа синаптикального переноса. Совместное культивирование 100 мкл этой клеточной суспензии с BSLB (см. шаг 1.2.15).
   10. Рассчитайте количество BSLB, необходимое для эксперимента; рассмотрите все различные мастер-миксы белков и титрования антигенов, которые будут тестироваться (либо биотинилированные мономеры HLA/MHC-пептидов, либо монобиотинилированные анти-CD3ε Fab).
   11. Соберите BSLB, выполнив те же шаги, что и в разделе 5 протокола, но на этот раз объедините все титрования белков и липидов, необходимые для восстановления сложной мембраны APC (рисунок 3A). Сохраняйте те же соотношения объема: объема между начальным объемом гранул диоксида кремния и объемом белковой смеси, используемой во время калибровки, а также временем и температурой, используемыми при загрузке BSLB. Например, если для первоначальной калибровки использовали 0,5 мкл гранул диоксида кремния на лунку и 100 мкл белковой смеси на лунку, поддерживайте соотношение 5:1000 об.:вольт для подготовки BSLB к кокультивированию с Т-клетками.
   12. После того, как BSLB были загружены интересующей их белковой смесью, дважды промойте BSLB HBS/HSA (BSA), чтобы удалить избыток несвязанных белков. Используйте скорость осаждения 300 × г в течение 2 минут при RT на каждом этапе стирки и выбросьте надосадочную жидкость.
   13. Суспендирование 5 × 105 BSLB на скважину в 200 μл.
   14. Переложите 100 μL на лунку на новую 96-луночную пластину с U-образным дном, чтобы сделать дубликат таким образом, чтобы окончательное количество BSLB на лунку составило 2,5 × 10⁵.
   15. Уменьшите BSLB при 300 × g в течение 2 минут и RT и выбросьте надосадочную жидкость.
   16. Ресуспендируйте BSLB, используя 100 μл суспензии Т-клеток; осторожно перемешайте, чтобы предотвратить образование пузырьков.
   17. Инкубировать кокультуры в течение 90 мин при 37 °C.
       заметка: В качестве альтернативы, клетки и гранулы могут быть ресуспендированы в буфере HBS/HSA (BSA) вместо RPMI, свободного от фенола-красного, для кокультуры. В этом случае инкубацию необходимо проводить в инкубаторе без содержания_CO2, так как этот газ быстро подкислит буфер в отсутствие бикарбоната.
   18. Охладите кокультуры клеток BSLB-T, предварительно инкубировав клетки в режиме RT в течение не менее 15 мин. Защищайте их от света.
   19. Центрифугируйте клетки в течение 5 мин при 500 × г и РТ; выбросьте надосадочную жидкость.
   20. Ресуспендируйте клетки в RT 2% BSA-PBS (Ca₂⁺ и Mg₂⁺-free) для блокирования. Поместите клетки на лед на 45 минут. Беречь от света.
   21. Во время инкубации клеток приготовьте мастер-смесь антител с использованием ледяного фильтра 0,22 мкм 2% BSA в PBS в качестве буфера для окрашивания, который обеспечит дополнительную блокировку.
       заметка: Некоторые партии антител, конъюгированных с красителями Brilliant Violet, имеют тенденцию связываться с BSLB неспецифически. Блокировка 5% BSA-PBS помогает снизить этот шум. С этого момента следите за тем, чтобы холодовая цепь не прерывалась.
   22. Уменьшите концентрацию до 500 × г в течение 5 минут и 4 °C. Прежде чем отбросить надосадочную жидкость, кратко убедитесь в наличии гранулы, осмотрев дно 96-луночного планшета с помощью подсветки.
   23. С помощью многоканальной пипетки ресуспендируйте клетки в окрашивающей мастер-смеси, содержащей оптимизированные концентрации антител.
       заметка: Используйте наконечники для дозатора без фильтра, чтобы предотвратить образование пузырьков и ошибки при распределении объемов окрашивания.
   24. К ним относятся меченые изотипом клетки и BSLB, флуоресцентные и нефлуоресцентные BSLB, а также клетки и BSLB, окрашенные отдельно. Учитывайте общее количество событий на лунку для всех контрольных групп (т.е. только BSLB, содержащих 5 × 10⁵ BSLB/лунку, и только контрольные клетки, содержащие 5 × 10⁵ клеток/лунку, чтобы избежать относительного увеличения антител на каждое окрашенное событие).
   25. Аккуратно перемешайте, дозируя вверх и вниз половину объема, и выдерживайте 30 минут на льду. Беречь от света.
   26. Дважды промойте клетки и BSLB с использованием ледяного 2% BSA-PBS, pH 7,4 и стадий осаждения 500 × г в течение 5 минут при 4 °C. Повторно суспендируйте промытые сокультуры в 100 μл PBS и немедленно приобретите.
   27. Если необходима фиксация, зафиксируйте с использованием 0,5% w/v PFA в PBS в течение 10 минут, промойте один раз и держите в PBS до получения. Беречь от света.
   28. Перед компенсацией приобретите стандарты MESP, гарантирующие, что как самые тусклые, так и самые яркие популяции попадают в линейный диапазон измерений.
   29. Получите компенсационные выборки, рассчитайте компенсацию и примените матрицу компенсации (ссылка) к эксперименту.
   30. Получение и сохранение не менее 2 × 10 4 стандартов MESF для каждого из каналов количественной оценки.
   31. Для сбора данных с помощью высокопроизводительных пробоотборников установите прибор на стандартное значение, объем отбора проб 80 мкл (или 80% от общего объема), скорость потока пробы от 2,0 до 3,0 мкл/с, объем смешивания проб 50 мкл (или 50% от общего объема во избежание образования пузырьков во время смешивания), смешивание проб 150 мкл/с, и перемешивание на лунку от 3 до 5.
   32. Приобретите минимум 1 × 10⁴ одиночных BSLB на образец (см. схему типового стробирования на рисунке 3B, панели (i)-(vi)).
   33. Промыть цитометр в течение 5 минут чистящим раствором, а затем 5 минутами сверхчистой воды перед выключением прибора. Если вы используете HTS, следуйте параметрам на вкладке HTS и параметру «Очистить».
   34. Экспорт файлов FCS.

3. Измерение синаптического переноса частиц в BSLB

1. Откройте файлы FCS эксперимента. Выберите популяцию ячеек и BSLB на основе их боковых и прямых областей рассеяния света (SSC-A против FSC-A), как показано на рисунке 3B (i).
2. Выберите события в окне непрерывного сбора данных (рис. 3B (ii)).
3. Сосредоточьтесь на одиночных событиях как ячеек, так и BSLB; сначала идентифицируйте одиночные ячейки на основе низкого W в последовательных вентилях FSC-W/FSC-H (синглеты-1, рисунок 3B панель (iii)) и SSC-W/SSC-H (синглеты-2; Рисунок 3B панель (iv)). Определите дополнительный вентиль синглет-3, выбрав события с пропорциональными FSC-A и FSC-H (рисунок 3B, панель (v)).
4. Извлеките MFI фракций MESF в пустом поле и от 1 до 4 и из одиночных клеток и MESF для каждого экспериментального образца.
5. Создание скорректированных значений MFI (cMFI) для дробей MESF с 1 по 4 путем вычитания MFI из популяции пустого валика из каждой дроби.
6. Сгенерируйте cMFI для отдельных BSLB и ячеек (см. Рисунок 3C панель (i)).
7. Используйте сигнал от BSLB, окрашенного контрольными антителами изотипа, для коррекции MFI BSLB, окрашенных антителами, против соответствующих маркеров Т-клеток. Используйте cMFI для расчета нормализованного процента синаптического переноса (NST%) с помощью уравнения, показанного на рисунке 3C (ii).
8. Если вместо этого вас интересуют частицы, специфически переносимые в ответ на запуск TCR, вычтите сигнал из нулевых BSLB из MFI агонистических BSLB. Используйте этот cMFI для вычисления NST%, управляемого TCR, используя уравнение, показанное на рисунке 3C (ii).
9. Если вас интересует определение общего количества молекул, переносимых в виде частиц через интерфейс Т-клетки-BSLB, получите эталонные гранулы MESF с использованием тех же настроек прибора и сеанса сбора данных для сокультур Т-клеток-BSLB.
10. Анализируйте популяции гранул MESF и извлекайте их cMFI. Вычислите наклон линии наилучшего соответствия для регрессионного анализа MESF по cMFI.
11. Используйте вычисленный наклон для извлечения количества MESP, депонированных на BSLB. Используйте cMFI, рассчитанные с использованием либо контроля изотипа, либо нулевых BSLB в качестве пробелов, чтобы извлечь количество MESP, переведенных конкретно на стимулирующие BSLB.
12. Рассчитайте количество молекул маркеров, переносимых в BSLB, разделив рассчитанные (средние) MESF на BSLB на значение F/P антитела количественного определения.

Результаты

Рисунок 1: Абсолютное количественное определение белков на поверхности АПК. (A) Пример количественного измерения ICAM-1 методом проточной цитометрии на поверхности В-клеток миндалины (Foll. Bc) и хелперные Т-клетки (TFH). (I-vii) Стратегия стробирования для анализа отдельных CXCR5+ Bc и TFH, выделенных из небных миндалин человека. Показана стратегия последовательного...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
96 Well Cell Cultture Plate, U-образное дно с крышкой, обработанная культура тканей, непирогенная	Костар®	No 3799	Для окрашивания FCM и совместного культивирования BSLB и клеток.
96 Well Cell Cultture Plate, V-образное дно с крышкой, обработанная культура тканей, безпирогенная.	Костар®	No 3894	Для FCM окрашивание клеток или шариков в суспензию.
Alexa Fluor 488 NHS Ester (сукцинимидиловый эфир)	Thermo Fisher Scientific, Инвитроген™	А20000
Alexa Fluor 647 NHS Ester (сукцинимидиловый эфир)	Thermo Fisher Scientific, Инвитроген™	А37573 и А20006
Multiwell 6 лунок Культура тканей, обработанная вакуумной газовой плазмой	сокол	353046	Для культивирования и размножения очищенных CD4+ и CD8+ Т-клеток.
Казеин из коровьего молока, подходит в качестве субстрата для протеинкиназы (после дефосфорилирования), очищенный порошок
Dynabeads Т-активатор человека CD3/ CD28	ThermoFisher Scientific, Gibco	11132Д
ДинаМаг-2	ThermoFisher Scientific, Инвитроген™	12321Д	Для удаления Dynabeads Т-активатор человека CD3/CD28 в объемах менее 2 мл
ДинаМаг-15™	ThermoFisher Scientific, Инвитроген™	12301Д	Для удаления Dynabeads™ Т-активатор человека CD3/CD28 в объемах менее 15 мл
Фетальная бычья сыворотка квалифицирована, один шо	ThermoFisher Scientific, Gibco	A3160801	Требуется инактивация тепла на 30 минут при 56 °C
античеловеческий CD154 (CD40L), клон 24-31	Биолегенда	310815 и 310818	Конъюгаты Alexa Fluor 488 и Alexa Fluor 647 соответственно
Армянский хомяк IgG Alexa Fluor 647 Контроль изотипа, клон HTK888	Биолегенда	400902	Маркирован внутри компании с помощью Alexa Fluor 647 NHS Ester (сукцинимидиловый эфир)
Настройка и отслеживание бусин цитометра BD	Бектон Дикинсон и компания (BD)	641319	Отслеживание производительности приборов до количественного FCM