Следующий метод адаптирован для тестирования конкурирующих штаммов со штаммами, продуцирующими ингибиторы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол включает в себя генерацию аэрозоля с бактериальными культурами. Это может быть выполнено только в замкнутом пространстве с учетом утвержденных на местном уровне соображений безопасности. Распыление культуры на агаровые пластины в безопасном шкафу уровня 2 сводит к минимуму загрязнение агаровых пластин и окружающей среды. Это также защитит исследователя от вдыхания аэрозоля распыляемых бактерий, что является серьезной проблемой, если исследователь использует организмы уровня локализации 2. Необходимо носить соответствующие средства индивидуальной защиты. Область вокруг чашки Петри лучше всего покрыть одноразовой впитывающей тканью. Рекомендуется обеззараживание после распыления с использованием ультрафиолетового света.
1. Подготовка агаровых пластин
- Приготовьте инфузию мозгового сердца (BHI) агар в соответствии с инструкциями производителя.
- Автоклавируйте агар BHI при 121 °C, 15 фунт-сила на квадратный дюйм (psi) в течение 20 мин или в соответствии с рекомендациями производителя автоклава для стерилизации.
- Насыпьте 15 мл аликвот стерилизованного BHI агара в стерильные чашки Петри и дайте ему застыть.
заметка: Убедитесь, что каждая агаровая пластина, используемая в пробе, происходит из одного и того же запаса агара и что в каждой пластине содержится одинаковое количество агара. Это ограничивает вариабельность доступных питательных веществ и диффузию ингибитора между планшетами, обеспечивая сопоставимость.
2. Приготовление стерильного бульона
- Приготовьте бульон BHI в соответствии с инструкциями производителя.
- Добавьте 10 мл аликвот BHI в стеклянные универсальные флаконы объемом 28 мл.
- Отвар BHI можно автоклавировать при температуре 121 °C, 15 фунтов на квадратный дюйм в течение 20 мин или в соответствии с рекомендациями производителя автоклава стерилизовать. <бр/>
заметка: Убедитесь, что весь бульон, используемый в анализе, получен из одной и той же партии бульона, автоклавного в одно и то же время, чтобы ограничить колебания питательных веществ, которые могут привести к изменению результатов.
3. Приготовление стерильных бутылок-испарителей
- Разберите флакон с испарителем.
- Распылите 5% поверхностно-активное чистящее средство через испаритель, чтобы устранить внутренние загрязнения, и замочите флакон испарителя, крышку и испаритель в 5% поверхностно-активном чистящем средстве на ночь.
заметка: При работе с поверхностно-активными чистящими средствами следует использовать перчатки и соответствующие средства индивидуальной защиты.
- Высушите испаритель, крышку и флаконы под стерильным колпаком.
- Наполните бутылку 70% этанолом, снова подсоедините испаритель и распылите немного этанола через испаритель.
- Закройте испаритель крышкой и храните этанол внутри до использования.
- Непосредственно перед использованием асептически промойте флакон стерильным бульоном BHI и распылите бульон через испаритель. <бр/>
заметка: Это предотвращает воздействие этанола на инокулюм, добавленный в бутылку в разделе 6.3.
4. Подготовка бактериальной культуры на ночь.
- Нанесите штаммы конкурента и ингибитора на стерильную агаровую пластину BHI и инкубируйте при температуре 37 °C аэробно в течение примерно 18 часов (в течение ночи).
заметка: Эта пластина производит запас бактерий, которые могут быть использованы для многократного повторения в течение одной недели при хранении при температуре 4 °C.
- Засейте 10 мл стерильного бульона BHI одной колонией необходимого штамма бактерий-конкурентов в универсальный флакон объемом 28 мл.
- Инкубируйте универсальную бутылку при температуре 37 °C аэробно в течение ночи, встряхивая при 250 об/мин в орбитальном шейкере.
5. Точечная культура изолята, продуцирующего ингибитор
- Подготовьте культуру (посевы) на ночь, как описано в разделе 4.
- Перед инокуляцией убедитесь, что агаровые пластины полностью сухие, без конденсата на крышке (например, путем инкубации пластины в течение 60 минут при 37 °C); это предотвратит распространение инокулюма по пластине от места инокуляции.
- Пипеткой нанесите 25 мкл ночной культуры на центр агаровых пластин. Избегайте полного нажатия на поршень пипетки, чтобы предотвратить попадание пузырьков воздуха, которые разбрызгивают культуру по агару.
- Дайте культуре высохнуть при комнатной температуре, чтобы ограничить распространение культуры. Инкубируйте агаровые пластины при температуре 37 °C аэробно в течение ночи.
6. Приготовление посевного материала для испытания штамма (штаммов) конкурента
- Подготовьте культуру на ночь, как описано в разделе 4. Развести ночную культуру в 10 раз в бульоне BHI до получения приблизительно 4 x 106 колониеобразующей единицы (КОЕ) мл-1 и суспензии наружного диаметра600 0,3 ±0,05,<бр/>
заметка: 10-кратное разведение не даст 4 x 106 КОЕ мл-1 для всех видов бактерий, рассчитайте необходимый коэффициент разбавления путем распределения серийных разведений между 1 x 10-1-1 x 10-6.
- Разбавленную культуру перелейте в стерильный пластиковый флакон для испарителя духов.
заметка: Общий объем должен быть больше, чем необходимо для количества распыляемых агаровых пластин. Примерно 250 μл на тарелку подходит для чашки Петри диаметром 9 см.
7. Анализ замедленного ингибирования роста
- Распылите культуру через каждую из бутылок испарителя, чтобы убедиться, что культура загружена в распылительный механизм перед распылением на агар.
- С расстояния примерно 15 см над агаром распылите примерно 250 мкл разведенной культуры (3 распыления типичного испарителя объемом 50 мл) по всей поверхности агара. Инкубируйте агаровые пластины при температуре 37 °C аэробно в течение ночи. Повторите то же самое для других пластин с таким же количеством распылений.
8. Интерпретация результатов анализа замедленного роста
- Измерьте зону ингибирования роста распыляемого штамма-конкурента (рис. 1A-C, от "X" до "X") в миллиметрах, вычитая диаметр центрального пятна ингибитора-продуцента (рис. 1A-C, от "Y" до "Y").
ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1E показано, как эти данные могут быть представлены
- Запишите оценку ясности для зон торможения.
заметка: Это говорит о степени наблюдаемого торможения. Примеры показаны на рисунке 1A-D, деформации, которые могут быть использованы для стандартизации, предложены в разделе репрезентативных результатов. Для оценки ясности можно использовать следующую шкалу: оценка ясности 0 для описания зоны полного торможения роста конкурирующего штамма. Оценка 1 описывает зону почти полного торможения роста, при этом в зоне очищения присутствуют только отдельные колонии. Оценка 2 обозначает видимую зону сниженного роста, рост в пределах этой зоны является сливающимся или близким к слиянию, но уменьшенной по плотности на >50 %. Оценка 3 означает лишь минимальное снижение роста, рост сливается и уменьшается менее чем на 50 %, а зона все еще видна и поддается измерению. Оценка 4 балла не указывает на отсутствие видимого торможения роста. Оценка 5 баллов означает, что рост конкурирующего штамма был увеличен в непосредственной близости от штамма, продуцирующего ингибитор теста. Примеры см. на рисунке 1. Эти оценки субъективны для экспериментатора.
