1. Анализ дигитонина с сальмонеллой, экспрессирующей mCherry (анализ на основе FACS)
- Приготовление бактерий
Примечание: В данном анализе используется сальмонелла дикого типа SL1344 (устойчивая к стрептомицину), экспрессирующая mCherry из плазмиды (pFPV, кодирующая mCherry под промотором rpsM). Бактериальный фагоцитоз и пролиферация не изменялись конститутивной экспрессией mCherry (данные не показаны).
- За 1 сутки до заражения штамм инокулируют в 3 мл LB среды с добавлением стрептомицина (90 мкг/мл) и ампициллина (100 мкг/мл, экспрессирующий вектор mCherry) в шейкере при 37 °C O/N.
- Гальванизация клеток на инфекцию.
- Посев BMDM дикого типа в 24-луночный планшет с плотностью 1,25 х 10 5 клеток/лунку в 1 мл первичной макрофагальной среды (DMEM с добавлением 10% сыворотки плода теленка (FCS, инактивированная при нагревании, 56 °C, 30 мин), 1% 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазитансульфоновой кислоты (HEPES), 1% заменимых аминокислот (NEAA), 1% L-глутамина и 10% надосадочной жидкости L929 (кондиционированная среда из макрофагального колониестимулирующего фактора (M-CSF), продуцирующих клетки L929). Посевные лунки согласно таблице 1 учитывают индивидуальные условия. Добавьте покровные стекла к скважинам, используемым в качестве контрольных (Таблица 1).
- Инкубируйте клетки в течение ночи в инкубаторе при температуре 37 °C и 5%CO2.
- Подготовка бактерий к заражению.
- На следующий день определите концентрацию сальмонеллы в ночной культуре, разбавив культуру 1:10 в фосфатно-солевом буфере (PBS) и измерив OD600 по сравнению с контролем, содержащим только PBS. Это гарантирует, что внешний диаметр600 измеряется в линейном диапазоне спектрофотометра.
- Рассчитайте концентрацию сальмонеллы на мл. OD600 от 1 соответствует 1 x 109 бактерий.
- Разведите бактерии в макрофагальной среде до достижения концентрации сальмонеллы 1,25 x 106 клеток/мл.
- Заражение клеток сальмонеллой.
- Удалите среду из МПДМ. Добавьте 1 мл макрофагальной среды в неинфицированные контрольные лунки (В1-В3, С1-С3). Добавьте 1 мл суспензии сальмонеллы в лунки А1 - А5 для достижения кратности инфекции (m.o.i.) 10 бактерий на клетку.
- Центрифугируйте планшет в течение 15 минут при 300 x g при 37 °C для синхронизации инфекции. Перенесите планшет в инкубатор при температуре 37 °C и 5%CO2.
- Уничтожение внеклеточной сальмонеллы с помощью гентамицина.
- Через 1 час после заражения извлеките планшет из инкубатора и добавьте 0,1 мл макрофагальной среды, содержащей 0,1 мг/мл гентамицина для уничтожения внеклеточных бактерий. Добавляйте гентамицин во все лунки, даже в неинфицированные контрольные лунки, чтобы гарантировать, что все клетки обрабатываются одинаково. Перенесите планшет в инкубатор при температуре 37 °C и 5%CO2.
- Промывка клеток.
- Через 2 часа после заражения извлеките планшет из инкубатора и 2 раза промойте все лунки 1 мл простого DMEM (предварительно подогретого до 37 °C) и замените его макрофагальной средой (предварительно подогретой до 37 °C), содержащей 10 мкг/мл гентамицина, чтобы предотвратить рост любых оставшихся внеклеточных бактерий. Перенесите планшет в инкубатор при температуре 37 °C и 5%CO2.
- Готовим свежие буферы с моющими средствами и антителами.
- Непосредственно перед желаемым моментом анализа приготовьте свежий исходный раствор дигитонина в концентрации 1 мг/мл в буфере KHM (110 мМ ацетата калия, 20 мМ HEPES, 2 мМ MgCl2, pH 7,3). Процедите помаду и разведите в буфере KHM до рабочей концентрации 50 мкг/мл дигитонина. Кроме того, готовят раствор 0,1% сапонина в буфере KHM, антитела против сальмонеллы, соединенного с флуоресцеином изотиоцианатом (CSA-1-FITC) в дозе 1/500, антикальнексином в дозе 1/100 или антипротеиндисульфидизомеразой (анти-PDI) в дозе 1/100 в буфере KHM с добавлением 3% бычьего сывороточного альбумина (БСА).
- Пемеабилизация клеток.
- Выньте планшет из инкубатора и промойте лунки 3 раза 0,5 мл KHM Buffer (предварительно подогретым до 37 °C). Удалите KHM Buffer и добавьте 0,25 мл простого KHM Buffer в лунки A4 и B1/C1, KHM Buffer with digitonin в лунки A1 - A3 и B2/C2, или KHM Buffer with saponin в лунки A5 и B3/C3 (согласно таблице 1). Инкубируйте ровно 1 минуту при RT и немедленно промойте все лунки 3 раза 0,5 мл буфера KHM (предварительно подогретого до 37 °C).
- Первичное окрашивание антителами.
- Удалите буфер KHM и добавьте в соответствующие лунки первичные растворы антител (Goat anti-Salmonella-FITC, 250 мкл/лунка, 0,1 мкг/мл) (рис. 1, табл. 1). Инкубировать планшет в течение 15 минут в инкубаторе при температуре 37 °C и 5%CO2.
- Промойте ячейки 1 мл PBS.
- Инфицированные клетки (скважины А1 - А5): анализ FACS
- Промойте ячейки 3 раза PBS и добавьте 0,5 мл ледяного PBS, содержащего 0,1% тритона. Переложите в пробирку FACS объемом 5 мл с крышкой для клеточного фильтра, чтобы разбить клеточные агрегаты. Храните образцы на льду.
- Проанализируйте образцы FACS. Используя полностью проникающие элементы управления, сначала установите ворота для общего количества бактерий на основе прямого и бокового рассеяния (FSC/SSC), а затем сигнал mCherry (610 нм ± фильтр 20 нм).
- Затем проанализируйте сигнал FITC в общей бактериальной популяции с использованием полностью пермеабилизированных и непермеабилизированных контрольных групп для установки ворот для цитозольных бактерий (FITC+, mCherry+) и вакуолярных бактерий (FITC-, mCherry+) (рис. 2).
- После установки ворот проанализируйте образцы и определите процентное соотношение цитозольных и вакуолярных бактерий с помощью программного обеспечения FlowJo в соответствии с протоколом производителя.
Таблица 1: Схема покрытия макрофагов, полученных из костного мозга (BMDM) в 24-луночном формате для последующей инфекции сальмонеллой, пермеабилизации и окрашивания.
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
| | Пермеабилизация | Окрашивание | |
| Стеклянный покровный колпак | сальмонелла | Дигитонин | сапонин | антисальмонеллеза | анти-кальнекцин | анти-PDI |
| А1 (образец) | -/+* | + | + | | + | | |
| А2 (образец) | -/+* | + | + | | + | | |
| А3 (образец) | -/+* | + | + | | + | | |
| А4 (без контроля пермеабилизации) | -/+* | + | | | + | | |
| А5 (полный контроль проникновения) | -/+* | + | | + | + | | |
| B1 (окрашен на кальнексин) | + | | | | | + | |
| В2 (окрашен на кальнексин) | + | | + | | | + | |
| В3 (окрашен для кальнексина) | + | | | + | | + | |
| C1 (окрашен для PDI) | + | | | | | | + |
| C2 (окрашен для PDI) | + | | + | | | | + |
| C3 (окрашен для PDI) | + | | | + | | | + |
