Все процедуры с участием людей были выполнены в соответствии с институциональными, национальными и международными рекомендациями по благополучию человека и были рассмотрены местным институциональным наблюдательным советом.
1. Буферный препарат для забора крови человека и выделения промытых тромбоцитов
- Приготовьте 100 мл водного раствора кислоты-цитрат-декстрозы (АКД) путем растворения 1,4 г моногидрата лимонной кислоты (C6H8O7•H2O, 66,6 мМ), 2,5 г дигидрата тринатрия цитрата (Na3C6H5O7•2 H2O, 85 мМ) и 2 г безводной D(+)-глюкозы. pH раствора составляет около 4,5.
- Готовьте исходные растворы для буфера Tyrode следующим образом
- Приготовьте исходный раствор 1, растворив 80 г хлорида натрия (NaCl), 2 г хлорида калия (KCl), 10 г гидрокарбоната натрия (NaHCO3) и 0,58 г моногидрата дигидрофосфата натрия (2PO4*H2O) в 500 мл дистиллированного H2O. Соответствующие конечные концентрации составляют 2,73 М, 53,6 мМ, 238 мМ и 8,4 мМ. Держите раствор при температуре 4 °C.
- Приготовьте исходный раствор 2, растворив 10,15 г гексагидрата дихлорида магния (MgCl2*6 H2O) (100 мМ) в 500 мл дистиллированной воды (H2O). Держите раствор при температуре 4 °C.
- Приготовьте исходный раствор 3, растворив 10,95 г (100 мМ) гексагидрата хлорида кальция CaCl2*6 Н2О в 500 мл дистиллированного Н2О. Выдерживайте раствор при температуре 4 °С.
- Приготовьте буфер Тироде, разбавив 2,5 мл стокового раствора 1 в конечном объеме 50 мл дистиллированнымН2О. Это соответствует конечным концентрациям 136,5 мМ NaCl, 2,68 мМ KCl, 11,9 мМ NaHCO3 и 0,42 мМ2PO4*H2O. Отрегулируйте pH до 7,35 и стерилизуйте путем фильтрации с помощью фильтров 0,22 мкм.
- Приготовьте 0,35% буфер альбумина Тироде (буфер ТА) путем разведения 5 мл исходного раствора 1, 1 мл стокового раствора 2, 2 мл стокового раствора 3, 0,5 мл 1М HEPES, 1,8 мл 200 г/л сывороточного альбумина человека и 0,1 г безводного D(+)-глюкозы в конечном объеме 100 мл дистиллированногоН2О.
- Отрегулируйте pH до 7,35 с помощью 1N соляной кислоты (HCl) и установите осмолярность на 295 мОсм/л, добавив дистиллированный H2O (10% от общего объема). Конечные концентрации в этом растворе составляют 124 мМ NaCl, 2,44 мМ KCl, 10,82 мМ NaHCO3, 0,38 мМ2PO4*H2O, 0,91 мМ MgCl2*6 H2O, 1,82 мМ CaCl2*6 H2O. Поддерживайте буфер TA при температуре 37 °C в течение всего эксперимента.
2. Сбор крови
- Соберите 45-50 мл венозной крови из предкубитальной вены с помощью иглы 19 G и без жгута или с низким жгутом в пробирки объемом 50 мл, содержащие антикоагулянт ACD (1 объем ACD на 6 объемов крови). Выбросьте первые 1-2 мл крови, чтобы избежать присутствия тромбина и тканевого фактора.
- После сбора смешайте кровь с ACD, осторожно перевернув пробирку. Инкубируйте образец в течение 10 минут при 37 °C.
3. Приготовление промытых тромбоцитов
- Предварительно нагрейте центрифугу до 37 °C. Все описанные ниже этапы центрифугирования выполняются при этой температуре.
- Собранную кровь разложить по 15 мл пробирок (5 мл на пробирку) и центрифугировать при 250 x g в течение 13 мин для получения обогащенной тромбоцитами плазмы, PRP.
заметка: Этот этап центрифугирования приводит к образованию трех слоев в образце: 1) Верхний слой, состоящий из плазмы, тромбоцитов и небольшой доли белых кровяных телец. 2) Промежуточный слой, часть, богатая лейкоцитами. 3) Нижний слой, который в основном состоит из эритроцитов.
- Соберите PRP путем осторожного пипетирования верхнего слоя в новую пробирку объемом 15 мл, чтобы максимально предотвратить загрязнение эритроцитами и лейкоцитами, и инкубируйте в течение 10 минут при 37 °C.
- Центрифугируйте PRP при 2 200 x g в течение 12 мин (для 5 мл PRP).
заметка: Этот этап центрифугирования следует выполнять с низким тормозом или без тормоза.
- Удалите надосадочную жидкость (бедную тромбоцитами плазму) и осторожно ресуспендируйте гранулу 10 мл буфера ТА, содержащего 2 мкл/мл гепарина (5 000 Ед/мл) и 2,5 мкл/мл 25 мкМ простациклина (PGI2) с помощью пластиковой пипетки Пастера. Инкубировать в течение 10 минут при 37 °C.
- Добавьте 2,5 μл/мл 25 μМ простациклина-I2 (PGI2) и центрифугируйте в течение 8 минут при 1 900 x g (с низким тормозом или без тормоза).
- Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу с помощью 5 мл буфера TA, содержащего 2,5 мкл/мл 25 мкМ PGI2 с помощью пластиковой пипетки Пастера. Инкубировать в течение 10 минут при 37 °C.
- В течение инкубационного периода пипетировать 150 мкл тромбоцитарной суспензии в пробирку объемом 1,5 мл и подсчитывать тромбоциты с помощью автоматизированного счетчика клеток (который определяет размер клеток крови путем измерения изменений сопротивления постоянному току).
- После 10-минутной инкубации добавьте 2,5 μл/мл 25 μМ PGI2 в тромбоцитарную суспензию и немедленно центрифугируйте при 1900 x g в течение 8 минут.
- Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу до концентрации 250 000 тромбоцитов/мкл с достаточным объемом буфера ТА (т.е. если количество клеток составляет 500 000 на мкл, ресуспендируйте в 10 мл буфера ТА), содержащего 32 мкл/мл апиразы в концентрации 0,01 Ед/мл (конечная концентрация 0,32 Ед/мл).
заметка: Высокая концентрация апиразы используется для предотвращения десенсибилизации рецепторов P2X пуринорецептора 1, P2X1, индуцированной спонтанной секрецией аденозинтрифосфата (АТФ) в отсутствие агонистов. Это важно, потому что коллаген-индуцированные реакции индуцируются быстрой паракринной/аутокринной активацией P2X1 АТФ, высвобождаемой из активированных тромбоцитов. Если сигнальный путь тромбоцитов не требует критического сохранения функции P2X1, используют апиразу 0,02 Ед/мл. Несколько исследований показали, что 0,02 Ед/мл апиразы позволяет избежать аденозиндифосфатного рецептора АДФ P2Y пуринорецептора 1 и десенсибилизации P2Y1 с незначительными ответами P2X1.
- Перед проведением агрегированных измерений клеточную суспензию инкубировать не менее 30 мин при 37 °С. Препарат стабилен в течение 5 – 8 часов.
4. Агрегирование
- Приготовьте фибриноген (56 мг/мл) в буфере Tyrode.
- Пипетируйте 260 мкл тромбоцитарной суспензии в стеклянные кюветы (рис. 1А; левая кювета), содержащие 10 мкл фибриногена (56 мг/мл) и магнитный стержень для перемешивания, затем инкубируйте суспензию в течение 2 - 3 мин при 37 °С в инкубационных лунках, присутствующих в агрегатометре (рис. 1В и 1С).
- Предварительно инкубировать с ингибитором Panx1 Brilliant Blue FCF путем добавления 10 мкл стокового раствора 2,8 мМ или 28 мМ (конечная концентрация 100 мкМ и 1 мМ соответственно) в течение 7 мин при 37 °C.
- Откалибруйте агрегатометр до предполагаемого значения агрегации 100%, измерив оптическую плотность (OD) кюветы, содержащей 10 мкл фибриногена (56 мг/мл), 10 мкл Brilliant Blue FCF (2,8 мМ или 28 мМ) и буфер TA без тромбоцитов.
- Поместите кювету в агрегационную яму при автоматическом перемешивании и нажмите соответствующую кнопку на клавиатуре компьютера, подключенного к агрегатометру (т.е. нажмите F1, если используется агрегационная яма 1).
заметка: Этот эксперимент, описанный ниже, включает в себя Brilliant Blue FCF. Состав, используемый для калибровки, должен быть адаптирован к экспериментальным условиям.
- Откалибруйте агрегатометр до предполагаемого значения агрегации 0%, используя тот же образец тромбоцитов, который будет использоваться для эксперимента при автоматическом перемешивании.
- Поместите кювету в ячейку агрегатора и нажмите соответствующую кнопку на клавиатуре компьютера, подключенного к агрегатометру. Подождите около 20-30 секунд, прежде чем продолжить. Эта задержка служит для того, чтобы гарантировать, что перед добавлением агонистов не произойдет никакой агрегации.
заметка: Поскольку любая разница в количестве тромбоцитов может повлиять на измеряемый внешний диаметр, шаг калибровки 0% необходимо повторять для каждого отдельного измерения.
- Добавьте в кювету 20 μL желаемого агониста, например, 15 μг/мл коллагена (1 μг/мл конечного) или 1,125 мМ арахидоновой кислоты (75 μM в конечную фазу). Немедленно начните запись при непрерывном автоматическом перемешивании, нажав соответствующую кнопку на клавиатуре компьютера, подключенного к агрегатометру.
заметка: Добавление агониста индуцирует активацию тромбоцитов. Агрегаты тромбоцитов можно четко различить в стеклянной кювете в конце эксперимента (рис. 1А; правая кювета).
- Запись автоматически останавливается через 6 минут. На этом этапе сохраните данные, нажав на иконку сохранения на компьютере.
заметка: Вычисление коэффициента агрегирования выполняется компьютером, который выражает конечные результаты процесса агрегирования в процентах.
