Клеточный анализ для идентификации агентов, взаимодействующих с CXCR4

Аннотация

Источник: Claes, S. et al., Анализ мобилизации Ca²⁺ на основе кинетической флуоресценции для идентификации агонистов, антагонистов и аллостерических модуляторов, связанных с G-белком.J. Vis. Exp.(2018)

Это видео иллюстрирует клеточный анализ с участием клеток глиобластомы, экспрессирующих хемокиновые рецепторы CXCR4. В анализе используется чувствительный к кальцию краситель для измерения изменений флуоресценции при взаимодействии агентов, что позволяет получить представление о динамике клеточной сигнализации.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Все шаги, описанные в разделах 1 и 2, выполняются в стерильных условиях в ламинарном шкафу.

1. Обслуживание U87. Клетки CD4.hCXCR4

1. Выращивайте клетки в колбах для культур T75 при температуре 37°C и 5%_CO2 в увлажненном инкубаторе.
   заметка: Клеточная линия in vitro, используемая в этом протоколе, представляет собой клеточную линию глиобластомы U87, стабильно экспрессирующую кластер дифференцировки 4 (CD4) и хемокиновый рецептор 4 человека CXC (CXCR4), и была описана ранее. Экспрессия CD4 и CXCR4 на клеточной поверхности постоянно контролируется с помощью проточной цитометрии, а уровни экспрессии остаются постоянными с течением времени (~ 100% CD4⁺ и ~ 100% CXCR4⁺ клеток). Подробное описание создания используемой клеточной линии и процедуры проточной цитометрии для исследования уровней экспрессии рецепторов не входит в рамки данного протокола.
   1. Клетки субкультуры при конфлюенции 80-85%. Дайте всем реагентам нагреться до комнатной температуры (RT) перед культивированием клеток.
   2. Удалите кондиционированную питательную среду из клеток и однократно промойте монослой клетки 5 мл фосфатно-солевого буфера (PBS).
   3. Добавьте 3 мл 0,25% трипсин-этилендиамина тетрауксусной кислоты (трипсин-ЭДТА) и равномерно распределите ее по монослою клетки. Затем удалите избыток трипсина-ЭДТА и инкубируйте до 5 минут при 37 °C до тех пор, пока клетки не начнут отделяться.
   4. Добавьте 10 мл свежей полной питательной среды (модифицированная среда Dulbecco's Eagle's Medium (DMEM) + 10% фетальная бычья сыворотка (FBS) + 0,01 M 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазиэтанасульфоновая кислота (HEPES) + соответствующие селекционные агенты). Восстановите суспендию клеток, аккуратно пипетируя их вверх и вниз. Перенесите клеточную суспензию в стерильную пробирку объемом 50 мл.
   5. Подсчитайте количество жизнеспособных клеток с помощью выбранного метода. В случае клеток глиобластомы U87 жизнеспособность обычно достигает ~ 100%.
      заметка: Номера ячеек можно определить несколькими способами. Мы обычно используем автоматизированную систему анализа клеток, основанную на окрашивании трипановым синим цветом (см. Таблицу материалов) в соответствии со стандартными процедурами обработки, но другие способы должны работать не менее хорошо.
   6. Добавьте 2 x 10⁶ или 3 x 10⁶ (жизнеспособных) клеток в конечный объем 25 мл свежей питательной среды в колбе для культур T75 и инкубируйте при 37 °C и 5% углекислом газе (CO₂).
      заметка: Если использовать 3 x 10⁶ ячеек, то через 2 дня слияние ячеек достигнет 80-90%. Если использовать 2 x 10⁶ ячеек, они достигнут того же слияния через 3 дня. Скорость роста клеток должна быть сначала определена опытным путем, если используются другие клеточные линии.

2. Посев клеток для мобилизационного анализа Ca²⁺

1. В день пропускания клеток (день 0) покройте 96-луночные пластины из полистирола с черными стенками и прозрачным дном (см. Таблицу материалов) 0,1% раствором желатина для облегчения прикрепления клеток.
   заметка: Покрытие 96-луночных планшетов желатином может быть опущено, если используются пластины с предварительно нанесенным покрытием, которые коммерчески доступны (см. Таблицу материалов). Рекомендуется оценить использование пластин с предварительно нанесенным покрытием вместо ручного нанесения покрытия для каждой исследуемой клеточной линии, прежде чем продолжать следовать протоколу.
   1. Приготовьте желатиновый раствор, добавив 1 г желатина к 100 мл PBS до получения 1% раствора. Разбавьте в 10 раз PBS перед дальнейшим использованием. Чтобы улучшить растворимость желатина, нагрейте раствор до 37 °C.
   2. Добавьте 100 мкл 0,1% раствора желатина в лунку 96-луночного планшета с помощью многоканальной пипетки. Инкубировать в течение 2 ч при РТ.
2. Тем временем подготовьте ячейки к посеву в покрытую 96-луночную пластину.
   1. Отделите клетки от колбы с культурой, повторно суспендируйте их в свежей питательной среде и подсчитайте методом окрашивания трипановым синим.
   2. Вращайте клетки в пробирке объемом 50 мл в течение 5 минут при 400 x g при RT.
   3. Ресуспендируйте клетки в свежей питательной среде (DMEM + 10% FBS + 1% HEPES, без антибиотиков) для получения плотности клеток 0,1 x 10⁶ (жизнеспособных) клеток/мл.
3. Удалите желатиновый раствор с пластин с черными стенками с прозрачным дном, перевернув пластину и высушив ее на салфетке. Добавьте 200 мкл PBS, чтобы удалить избыток желатина, и снова переверните тарелку.
4. Дозируйте 200 мкл клеточной суспензии (что соответствует 0,2 x 10⁵ клеток) на лунку в 96-луночном планшете, покрытом желатином (в дальнейшем этот планшет будет именоваться «измерительной пластиной»).
5. Инкубируйте планшет в течение ночи при 37 °C и 5% углекислом газе (CO₂).

3. Загрузка ячеек флуоресцентным красителем Ca²⁺ -чувствительным

1. В 1-й день проводят собственно мобилизационный анализ Ca²⁺, начиная с загрузки засеянных клеток флуоресцентным Ca²⁺-связывающим красителем флуоресцентным ацетоксиметилом флуоресцентного Ca 2+ ацетоксиметила (fluo-2 AM).
   1. Приготовьте буфер для анализа, добавив 40 мл HEPES (1 M) к 200 мл сбалансированного раствора соли Hank's Balanced Salt Solution (HBSS, 10x, без фенолового красного, без бикарбоната натрия). Добавьте сверхчистую воду до получения конечного объема 2 л и добавьте 4 г бычьего сывороточного альбумина (BSA). Растворите BSA с помощью магнитного перемешивания. Отрегулируйте pH до 7,4 (с гидроксидом натрия, NaOH) и отфильтруйте раствор.
      заметка: На всех последующих этапах используется один и тот же буфер, называемый «буфером для анализа».
   2. Приготовьте стоковый раствор (4 мМ в диметилсульфоксиде (ДМСО)) флуоресцентного Са2⁺-чувствительного красителя флуоресцентного флуоресцентного красителя флуоресцентного Са2+. Избегайте чрезмерного воздействия света. Растворите 1 мг флуо-2 AM (молекулярная масса: 1,061 г/моль) в 235,6 μл ДМСО.
   3. Приготовьте рабочий раствор флуо-2 АМ. Для одного 96-луночного испытательного планшета смешали 12,5 мкл стокового раствора флуоре-2 АМ (4 мМ) и 12,5 мкл раствора полиола неионогенного поверхностно-активного вещества (например, плуронового f-127) (20% масс/объем в ДМСО, см. Таблицу материалов). Добавьте 22 мкл этой смеси в буфер для анализа объемом 11 мл в пробирке объемом 15 мл. Конечная концентрация флуоре-2 АМ составляет 4 мкМ. <бр/> заметка: Неионогенное поверхностно-активное вещество используется в качестве диспергирующего агента для улучшения растворимости в воде флуо-2 АМ и, как следствие, для увеличения нагрузки на ячейки. Чтобы солюбилизировать поверхностно-активное вещество в ДМСО, нагрейте образец до 37 °C и регулярно перемешивайте до получения однородного раствора.
   4. Удалите питательную среду из ранее засеянных ячеек в 96-луночной измерительной пластине, перевернув пластину и высушив ее на бумажном полотенце.
   5. Добавьте 100 мкл загрузочного раствора красителя в лунку с помощью многоканальной пипетки и инкубируйте в течение 45 мин при RT в темноте.

4. Получение 96-луночных полипропиленовых пластин, содержащих хемокиновый лиганд CXC 12 (CXCL12) или исследуемые соединения

1. Получите круглодонные полипропиленовые (ПП) 96-луночные планшеты (см. Таблицу материалов).
   1. Дайте исходному раствору CXCL12 (1 мг/мл) и исходному раствору исследуемых соединений сбалансироваться при RT.
      заметка: Исходный раствор CXCL12 готовят в ультрачистой воде с добавлением 0,01% Tween20 и хранят при -20 °C в виде одноразовых аликвот.
   2. Приготовьте 5-кратный концентрированный раствор CXCL12 в буфере для анализа (250 нг/мл, что равно 31,25 нМ) и 5-кратное концентрированное разведение каждого соединения (в буфере для анализа).
   3. Распределите исходные растворы в соответствующий 96-луночный планшет в соответствии с заранее заданной схемой расположения планшетов. Дозируйте 75 мкл/лунку в планшете, содержащем CXCL12 («хемокиновая пластина»), и диспенсируйте 50 мкл/лунку в планшете, содержащем соединения («компаундная пластина»).
      заметка: Оба соединения и CXCL12 в конечном итоге будут разбавлены в 5 раз после дозирования в измерительной пластине. Также важно включить отрицательные контрольные лунки, содержащие только буфер для анализа, как в составной планшет, так и в хемокиновый планшет. Кроме того, необходимо включить положительные контрольные лунки (т.е. лунки с CXCL12 в хемокиновой пластине, но с буфером для анализа в соответствующих лунках составной пластины).

5. Настройки протокола на считывателе флуоресцентных микропланшетов

ПРИМЕЧАНИЕ: Флуоресцентный микропланшетный ридер, используемый в этом протоколе, упоминается в Таблице материалов.

1. Сначала включите блок охлаждения считывателя флуоресцентных пластин, а затем включите сам считыватель флуоресценции. Подождите несколько минут и откройте программное обеспечение системы.
2. Создайте протокол анализа с помощью меню перетаскивания, которое включает в себя следующие шаги:
   1. В окне "Настройки" выберите 'Read_Mode' с длиной волны возбуждения: 470-495 нМ; и длиной волны излучения: 515-575 нМ.
      заметка: Выбранные длины волн подходят для использования с чувствительным к Ca²⁺ красителем fluo2.
   2. Включите в комплект бокс «Mix with TF» (передаточная жидкость) для автоматического смешивания составов в компаундной пластине, которая будет размещена в источнике в 2 положениях устройства (см. пункт 6.4). Выберите 15 мкл раствора в каждой лунке, который будет автоматически отсасываться и перемешиваться три раза. Отрегулируйте высоту наконечников пипеток на 20 μл ниже поверхности жидкости. Установите скорость аспирации и дозирования на уровне 50 мкл/с. <бр/> заметка: Высота наконечников пипеток относится к объему, оставшемуся под наконечниками пипеток. Например, если лунки составной пластины содержат 50 мкл, то высота 30 мкл соответствует 20 мкл ниже поверхности жидкости. Объем раствора, используемого для смешивания, скорость смешивания, положение наконечников пипеток во время смешивания и количество циклов смешивания могут быть отрегулированы с помощью программного обеспечения.
   3. В поле "Transfer Fluid" укажите, что 20 μL из каждой лунки из составной пластины будет передаваться в измерительную пластину. Расположите наконечники пипеток на глубине 20 μл ниже поверхности жидкости, т.е. на высоте 30 μл во время аспирации соединений и на высоте 60 μл во время диспенсирования в измерительной пластине. Установите скорость аспирации на уровне 50 мкл/с и скорость дозирования на уровне 25 мкл/с. <бр/> заметка: Составной планшет содержит 50 мкл раствора на лунку (см. шаг 4.1.3), таким образом, высота 30 мкл соответствует положению на 20 мкл ниже поверхности жидкости. Измерительная пластина будет содержать 80 мкл буфера для анализа на лунку (см. шаг 6.3), таким образом, высота 60 мкл соответствует аналогичному положению наконечников.
   4. Выберите кнопку "Читать с помощью TF". В течение первого интервала выберите 60 считываний (флуоресцентных измерений) с интервалом считывания 1 с. Определите, что перед нанесением соединений в измерительную пластину записывается 10 прочтений, а после этого — 50 прочтений. Определите второй интервал с интервалом чтения 30 секунд и 18 чтениями.
      заметка: На этом этапе флуоресценция будет измеряться кинетически (через определенные промежутки времени) в общей сложности ~ 10 минут.
   5. Включите кнопку «Советы по стирке» в протокол три раза. На каждом этапе промывки выберите тип жидкости: жидкость A (сверхчистая вода) или жидкость B (70% этанола), количество циклов стирки (1), скорость насоса (Fast) и количество нажатий (5) на каждом этапе стирки.
      заметка: На первом и последнем этапах промывки используется жидкость А, на втором этапе промывки используется жидкость В.
   6. Включите функцию «Пауза Пипеттор». Установите пипетку на паузу на 300 с.<бр/> заметка: При включении этого шага в протокол головка пипетки, которая встроена в устройство для чтения флуоресцентных пластин, сделает паузу на 5 минут, прежде чем продолжить протокол.
   7. Включите в комплект поле «Смешивание с TF», чтобы обеспечить автоматическое смешивание раствора CXCL12 в хемокиновой пластине, которая будет расположена в положении источника 3 устройства (см. шаг 6.4). Выберите 15 мкл раствора в каждой лунке, который будет автоматически отсасываться и перемешиваться три раза. Во время аспирации и смешивания расположите наконечники пипеток на 20 μл ниже поверхности жидкости. Скорость аспирации и дозирования установлена на уровне 50 мкл/с. <бр/> заметка: Аналогично шагу 5.2.2, эти параметры можно регулировать.
   8. В следующем поле «Жидкость для переноса» укажите, что 25 μл из каждой лунки хемокиновой пластины будут передаваться в измерительную пластину. Расположите наконечники на 20 мкл ниже поверхности жидкости, т.е. на высоте 55 мкл во время аспирации из хемокинового планшета, содержащего 75 мкл/лунку (см. шаг 4.1.3), и на высоте 80 мкл во время диспенсирования в измерительной пластине. Установите скорость аспирации на уровне 50 μл/с и скорость дозирования на уровне 25 μл/с.
   9. Включите кнопку "Читать с помощью TF". В течение первого интервала выберите 145 операций чтения с интервалом чтения 1 с. Определите, что перед нанесением CXCL12 в измерительную пластину записывается 5 прочтений, а после этого — 140 прочтений. Определите второй интервал с интервалом чтения 6 с и выберите 20 прочтений.
      заметка: В совокупности по всему протоколу записывается 243 считывания (флуоресцентные измерения): 78 на шаге 5.2.4 и 165 на шаге 5.2.9.
   10. Аналогично шагу 5.2.5, включите в протокол кнопку "Советы по мытью" три раза.
       заметка: Включение этого шага в конец протокола позволяет повторно использовать наконечники для проведения другого анализа без необходимости их замены.
3. Установите температуру прибора на уровне 37 °C, нажав кнопку «Установить температуру на столике» и выбрав 37 °C.

6. Проведение флуоресцентного анализа

1. После того, как измерительная пластина была инкубирована с загрузочным буфером в течение 45 минут (см. шаг 3.1.5), извлеките буфер, перевернув пластину, и высушите его на салфетке.
2. Промойте засеянные клетки, добавив 150 μл/лунку буфера для анализа, и инкубируйте в течение 2 минут.
3. Снова снимите буфер, перевернув пластину. Добавьте 80 μл/лунку буфера для анализа с помощью многоканальной пипетки.
4. Поместите все планшеты в устройство в соответствующее положение: композитную пластину в положение источника 2, хемокиновую пластину в положение источника 3 и измерительную пластину в положение считывания. Поставьте коробочку с черными типсами в положение источника 1 типс. Закройте дверцу устройства и инкубируйте в течение 5 минут, прежде чем продолжить протокол.
5. Нажмите кнопку «Проверка сигнала протокола», чтобы определить единицы относительного фона (RLU) и дисперсию флуоресценции на пластине. Появится новое окно. Выберите "Тестовый сигнал".
   заметка: На этом этапе фоновые RLU определяются камерой устройства с усиленной связью заряда (ICCD), которая встроена в оптический отсек флуоресцентного считывающего устройства. Эти RLU возникают в результате возбуждения Ca2⁺-чувствительного красителя (fluo-2) светоизлучающими диодами (LED) (длина волны выхода светодиода 470-495 нм). Значения 8 000-10 000 RLU хорошо подходят для этого применения. При необходимости RLU можно адаптировать, изменяя интенсивность возбуждения (Select Exc. Intensity) или затвор камеры (Select Gate Open). Отклонение по номерному знаку в идеале должно быть менее 7,5%.
6. Выберите «Обновить», если получены фоновые значения 8 000-10 000 RLU. Сохраните основной протокол, нажав кнопку Сохранить.
   заметка: Таким образом, настройки из теста сигнала протокола будут перенесены в основной протокол.
7. Запустите анализ, нажав кнопку «RUN».

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Флуо-2 АМ	Абкам	АБ142775	Флуоресцентный Са2+ чувствительный краситель
Плуронический F-127	сигма	П2443-250Г	Плуроновая кислота
желатин	сигма	Г9391
AMD3100	сигма	А5602-5 мг	Специфический антагонист CXCR4
Маравирок	Добрый подарок от AnorMed		Антиретровирусный препарат, антагонист CCR5
Хемокиновый лиганд CXCL12	ПепроТех	300-28А
Хемокиновый лиганд CCL5	ПепроТех	300-06
Фетальная бычья сыворотка (FBS)	Gibco (Life Technologies)	10270-106
Бычий сывороточный альбумин (BSA)	сигма	А1933-25Г
Модифицированная орлиная среда Дульбекко (DMEM)	Gibco (Life Technologies)	41965-039
HBSS (10 x), кальций, магний, без фенола красного	Gibco (Life Technologies)	14065-049
ГЕПЕС (1 М)	Gibco (Life Technologies)	15630-056
Трипсин-ЭДТА (0,25 %), фенол красный	Gibco (Life Technologies)	No 25200-056
Фосфатно-солевой буфер Дульбекко (DPBS)	Gibco (Life Technologies)	14190-094
Пробирки Falcon, 50 мл	Greiner Bio-One	Телефон: 227 261
Колба для культуры тканей (T75)	Корнинг	353024
Черная тарелка, 96-луночная, прозрачное дно, с крышкой	Costar/Fisher Scientific	10530753	Пробирная пластина (96-лунка), для посева клеток
Полипропиленовые (ПП) пластины	Thermo Scientific (VWR)	732-2661	Пластины, используемые для приготовления составных пластин и хемокиновых пластин, круглое дно
Высокопроизводительная система клеточного скрининга FLIPR Tetra	Молекулярные приборы		Люминесцентный считыватель со встроенной головкой пипеттора и камерой ICCD
Светодиодный модуль FLIPR Tetra 470 - 495 нм	Молекулярные приборы	0200-6128 (Английский)	Светодиоды для возбуждения флуоресцентного чувствительного красителя Ca2+
Эмиссионный фильтр FLIPR Tetra 515 - 575 нм	Молекулярные приборы	0200-6203 (Английский)	Фильтр излучения, совместимый с флуоресцентным красителем
Флипр Tetra 96 Головка	Молекулярные приборы	0310-4536 (Английский)	96-луночная головка дозатора, встроенная в считыватель флуоресцентных планшетов
СкринВоркс	Молекулярные приборы		Программное обеспечение, используемое для анализа и визуализации данных на FLIPR Tetra
ВИ-СЕЛЛ	Бекман Коултер		Анализатор жизнеспособности клеток
Corning CellBIND 96 Well Flat Clear Bottom Черные полистирольные микропластины, с крышкой, стерильные	Корнинг	No 3340	Предварительно окрашенные 96-луночные пробирные пластины, которые могут представлять собой альтернативу ручному нанесению покрытия на пробирную пластину.