1. Сбор клеток и измерение активности α-галактозидазы А или кислоты α-глюкозидазы
- Забор клеток
- В день сбора урожая извлеките клетки из инкубатора и аспирируйте среду. Тщательно промойте клетки 2 раза PBS с Ca2+ и Mg2+,
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг имеет решающее значение, потому что DGJ и DNJ являются мощными ингибиторами α-галактозидазы и α-глюкозидазы соответственно, и любой оставшийся вариант сделает тест недействительным.
- Добавьте 200 μL деионизированной воды непосредственно на верхнюю часть ячеек. Промойте клетки с планшета и переложите их в реакционную пробирку объемом 1,5 мл.
2. Гомогенизация путем замораживания и размораживания
- Поместите образцы в подходящий пенопластовый штатив и сделайте вихрь на 5 секунд, чтобы сделать лизис более эффективным. Образцы помещают чередуя в жидком азоте на 10 с и в водяную баню комнатной температуры до полного оттаивания (5 мин).
- Повторите эту процедуру 5 раз, а затем вращайте образцы в течение 5 минут при давлении 10 000 x g. Сохраните надосадочную жидкость и пипетку в новой реакционной пробирке.
3. Определение концентрации белка с помощью анализа бицинхониловой кислоты (BCA)
- Для каждого образца подготовьте свежую пробирку, содержащую 40 мкл деионизированного H2O и добавьте 10 мкл образца. Перемешайте раствор путем кратковременного вортекса и перенесите 10 мкл в полость 96-луночного планшета (каждый образец в трех экземплярах). Разведите стоковый раствор бычьего сывороточного альбумина (БСА) в дозе 2 мг/мл в деионизированном H2O следующим образом, чтобы получить стандартную кривую: 50 μL H2O/50 μL BSA; 60 μL H2O/40 μL BSA; 70 μL H2O/30 μL BSA; 80 μL H2O/20 μL BSA; 90 μL H2O/10 μL BSA; 100 μL H2O.
- Начните реакцию, добавив 200 мкл реагента BCA (реагент А и реагент В, смешанные в соотношении 50:1) и инкубируйте в течение 1 ч в темноте при 37 °C при незначительном перемешивании на орбитальном вибростенде (300 об/мин). Измерьте поглощение на длине волны 560 нм с помощью считывателя пластин.
заметка: Образцы обычно содержат от 1 до 1,5 мкг белка на мкл.
4. Измерение активности фермента с искусственными субстратами 4-Methylumbelliferyl (4-MUG)
- Расчетное количество каждого образца и пипетки развести в свежих реакционных пробирках объемом 1,5 мл до получения 0,05 (для α-галактозидазы А) или 0,5 (для кислой α-глюкозидазы) мкг белковых растворов/мкл. Снова переведите образцы на вихрь в течение 5 с и пипетируйте 10 мкл этого разведения в 96-луночный планшет (каждый образец в двух экземплярах).
- Начните реакцию, добавив 20 μL соответствующего раствора субстрата:
Для α-галактозидазы А: 2 мМ 4-метилумбеллиферил-α-D-галактопиранозида (4-MU-gal) в 0,06 М фосфатцитратном буфере, pH 4,7,
Для кислой α-глюкозидазы: 2 мМ 4-метилумбеллиферил α-D-глюкопиранозид (4-MU-глу) в 0,025 М ацетата натрия, pH 4,0.
- Ферментативные реакции инкубировать в течение 1 ч в темноте при 37 °C при незначительном перемешивании на орбитальном вибростенде (300 об/мин). Завершите реакцию добавлением 200 мкл 1,0 М, рН 10,5 регулируемого глицин-NaOH буфера.
- Подготовьте стандартную кривую 4-метилумбеллиферона (4-MU) из запаса 0,01 мг/мл следующим образом:
100 мкл H2O/no 4-MU; 80 мкл H2O/ 20 мкл 4-MU; 60 μL H2O/ 40 μL 4-MU; 40 μL H2O/ 60 μL 4-MU; 20 μL H2O/ 80 μL 4-MU; no H2O/ 100 мкл 4-MU, пипетировать по 10 мкл каждого разведения в 96-луночный планшет (в двух экземплярах) и добавить 200 мкл 1,0 М глицин-NaOH буфера в каждую лунку для регулировки объема и pH.
- Измерьте активность фермента в флуоресцентном считывателе, оснащенном соответствующим набором фильтров, и проанализируйте данные с помощью соответствующего программного обеспечения для устройства для чтения флуоресценции.
заметка: Оба субстрата 4-MUG восстанавливаются до 4-MU под воздействием α-галактозидазы А или кислой α-глюкозидазы. Высвобожденный 4-MU представляет собой флуорохром, который может быть измерен на длинах волн возбуждения и излучения на длинах волн 360 и 465 нм соответственно с помощью микропланшетного флуоресцентного считывателя.
