$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Анализ на инактивацию вируса
Примечание: Примеры инкубационного периода и дозы вируса для различных вирусов перечислены на рисунке 1A. Более высокие концентрации вируса также можно проверить, увеличив MOI/PFU.
- Высейте клетки Huh-7,5 в 96-луночный планшет (1 × 10 4 клеток на лунку) и инкубируйте при 37 °C в инкубаторе с 5% CO2 O/N для получения монослоя.
- Инкубируйте испытуемые соединения или контрольные соединения (конечные концентрации: CHLA = 50 мкМ; PUG = 50 μM; гепарин = 1 000 мкг/мл; ДМСО = 1%) с частицами ВГС при температуре 37 °C (рис. 1A, «Долгосрочный») в соотношении 1:1. Например, к 100 мкл вирусного инокулята, содержащего 1 х 104 ФОЕ, добавляют 100 мкл рабочего разбавления 100 мкМ CHLA; это дает обработку CHLA при конечной концентрации 50 мкМ.
- Развести вирусно-лекарственную смесь до «субтерапевтической» (неэффективной) концентрации исследуемых соединений. Например, неэффективная концентрация CHLA и PUG против HCV составляет 1 мкМ31; Таким образом, для этого требуется 50-кратное разведение вирусно-лекарственной смеси, что может быть достигнуто 9,8 мл базальной среды (среда для культивирования клеток с 2% FBS).
Примечание: Разведение до субтерапевтической концентрации предотвращает значительное взаимодействие между исследуемыми соединениями и поверхностью клетки-хозяина и позволяет изучить эффект лечения на бесклеточные вирионы. Следует отметить, что это разведение зависит от противовирусной дозы испытуемых соединений против конкретной вирусной инфекции и определяется до проведения данного конкретного анализа.
- Для сравнения смешайте вирус с исследуемыми соединениями и немедленно разбавьте (без инкубационного периода) до субтерапевтической концентрации до начала заражения (рисунок 1A, «Краткосрочный»).
- Добавьте 100 мкл разведенной лекарственной смеси HCV на монослой клеток Huh-7,5 (количество вируса теперь составляет 1 x 102 FFU; итоговый MOI = 0,01) и инкубируйте в течение 3 часов при 37 °C для обеспечения адсорбции вируса.
- После заражения удалите разведенную инокулянту и аккуратно промойте лунки 200 мкл PBS дважды.<бр/>
заметка: Выполняйте промывку осторожно, чтобы избежать поднятия ячеек.
- Нанесите по 100 мкл базальной среды в каждую лунку и инкубируйте при 37 °C в течение 72 часов.
- Проанализируйте возникшую инфекцию путем анализа надосадочной жидкости на активность люциферазы.
