Примечание: Убедитесь, что все процедуры, связанные с культивированием клеток и заражением вируса, проводятся в сертифицированных колпаках биобезопасности, которые соответствуют уровню биобезопасности обрабатываемых образцов. Для описания протоколов в качестве модельного вируса используется ВГС, меченный репортером Gaussia luciferaza. В контексте репрезентативных результатов соединения хебулаговая кислота (CHLA) и пуникалагин (PUG) используются в качестве кандидатов на противовирусные препараты, которые нацелены на взаимодействие вирусных гликопротеинов с гликозаминогликанами клеточной поверхности на ранних стадиях проникновения вируса. Гепарин, который, как известно, препятствует проникновению многих вирусов, используется в качестве положительного контроля в этом контексте.
1. Клеточная культура, препарат соединения и цитотоксичность соединения
- Вырастите соответствующую клеточную линию для анализируемой системы вирусной инфекции (табл. 1). При ВГС выращивают клетки Huh-7,5 в модифицированной среде Дульбекко Eagle's Medium (DMEM) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 200 ЕД/мл пенициллина G, 200 мкг/мл стрептомицина и 0,5 мкг/мл амфотерицина B.
- Готовьте исследуемые соединения и контрольные вещества с использованием соответствующих растворителей: например, растворяйте CHLA и PUG в диметилсульфоксиде (ДМСО); готовьте гепарин в стерильной воде двойной дистилляции. Для всех последующих разведений используйте питательные среды.
Примечание: Конечная концентрация ДМСО в испытуемых комплексах составляет менее 1% в экспериментах; 1% ДМСО включен в качестве отрицательного контроля в анализы для сравнения.
- Определить цитотоксичность исследуемых соединений (например, CHLA и PUG) на клетках вирусной инфекции с помощью реагента, определяющего жизнеспособность клеток, такого как XTT (2,3-бис[2-метокси-4-нитро-5-сульфоффенил]-5-фениламино)-карбонил]-2H-тетразолия гидроксид):
- Для ВГС высить клетки Huh-7,5 в 96-луночный планшет (1 × 10 4 клеток на лунку) и инкубировать при 37 °С в 5%CO2 инкубаторе O/N до получения монослоя.
- Нанесите контрольные (1%) или возрастающие концентрации ДМСО исследуемых соединений CHLA и PUG (например, 0, 10, 50, 100 и 500 мкМ) в культуральные лунки в трех экземплярах.
- Инкубируйте при 37 °C в течение 72 часов, затем выбросьте среду из планшета и дважды промойте клетки 200 μл фосфатно-солевого буфера (PBS).
- Добавьте 100 μл раствора для анализа из набора для токсикологического анализа in vitro на основе XTT в каждую лунку и инкубируйте планшеты при 37 °C в течение еще 3 часов, чтобы обеспечить производство формазана XTT.
- Определите поглощение с помощью считывателя микропланшетов на тестовой длине волны 492 нм и опорной длине волны 690 нм.
- Рассчитайте процент выживших клеток по следующей формуле: жизнеспособность клеток (%) = At / As × 100%, где «At» и «As» относятся к абсорбции исследуемых соединений и обработок с контролем растворителя (например, 1% ДМСО) соответственно. Определите концентрацию 50% клеточной цитотоксичности (CC50) исследуемых соединений с помощью аналитического программного обеспечения, такого как GraphPad Prism, в соответствии с протоколом производителя.
2. Считывание вирусной инфекции
Примечание: Считывание вирусной инфекции зависит от используемой вирусной системы и может включать такие методы, как анализ бляшек или измерение сигналов репортеров от вирусов, помеченных репортерами. Ниже описан метод выявления репортерной инфекции ВГС, основанный на активности репортерной люциферазы.
- Соберите надосадочную жидкость из зараженных лунок и осветите при 17 000 x g в микроцентрифуге в течение 5 мин при 4 °C.
- Смешайте 20 мкл испытуемой надосадочной жидкости с 50 мкл люциферазного субстрата из набора для анализа люциферазы Gaussia и непосредственно измерьте люминометром в соответствии с инструкциями производителя.
- Экспрессируйте инфекционность ВГС в виде log10 относительных световых единиц (RLU) для определения вирусного ингибирования (%) и рассчитайте 50% эффективную концентрацию (EC50) тестируемых соединений против инфекции HCV с помощью алгоритмов программного обеспечения GraphPad Prism в соответствии с протоколом производителя.
3. Вирусный анализ/сплав
Примечание: Примеры инкубационных периодов и доз вирусов для различных вирусов перечислены на рисунке 1A "Вход/Слияние". Более высокие концентрации вируса также можно проверить, увеличив MOI/PFU.
- Семена Huh-7,5 клеток в 96-луночный планшет (1 × 104 клеток на лунку) и инкубируют при 37 °C в инкубаторе с 5% CO2 O/N для получения монослоя.
- Предварительно охладите монослои ячеек в планшетах при температуре 4 °C в течение 1 часа.
- Инфицирование клеток ВГС (множественность инфекции, MOI = 0,01) при 4 °C в течение 3 ч. Например, используйте 100 мкл вирусного инокулята, содержащего 1 x 102 фокусных образующих единиц (FFU).
заметка: Добавьте вирусный посев на лед и затем инкубируйте в холодильнике при температуре 4 °C для поддержания температуры на уровне 4 °C, что позволяет связывать вирусы, но не проникать внутрь.
- Удалите надосадочную жидкость и аккуратно промойте монослои клеток 200 мкл ледяного PBS дважды.<бр/>
заметка: Выполняйте промывку осторожно, чтобы избежать поднятия ячеек.
- Обработать лунки исследуемыми составами или контрольными составами (конечные концентрации: CHLA = 50 мкМ; PUG = 50 μM; гепарин = 1 000 мкг/мл; ДМСО = 1%) и инкубировать при 37 °C в течение 3 часов. Например, добавьте 10 мкл рабочего разбавления CHLA 500 мкМ в 90 мкл среды, перемешайте и обработайте лунки; это дает обработку CHLA в конечной концентрации 50 мкМ.
заметка: Переход с 4 °C на 37 °C теперь облегчает процесс проникновения/слияния вируса и, следовательно, позволяет оценить влияние тестируемых соединений на этом конкретном этапе.
- Аспирируйте содержащую лекарственную жидкость надосадочную жидкость и удалите неинтернализованные внеклеточные вирусы путем промывания 200 мкл цитратного буфера (50 мМ цитрата натрия, 4 мМ хлорида калия, pH 3,0) или PBS. Внесите 100 мкл базальной среды перед инкубацией при 37 °C в течение 72 часов.
- Проанализируйте полученную инфекцию, проанализировав надосадочную жидкость на активность люциферазы, как описано в статье «2. Считывание вирусной инфекции».
