Колориметрическое определение бактериального биомаркера с помощью модифицированного лакмусового теста

Аннотация

Источник: Трам, К., и др. Колориметрическое обнаружение бактерий с помощью лакмусового теста. J. Vis. Exp. (2016).

Это видео демонстрирует колориметрический метод обнаружения E. coli, в котором биомаркер E. coli активирует ДНК-фермент, что приводит к расщеплению РНК-линкации и отрыву конъюгата ДНК-уреаза. Последующий колориметрический анализ обнаруживает биомаркер E. coli через изменения pH, вызванные аммиаком.

Протокол

1. Подготовка клеток E. coli к тестированию

1. Для получения желаемой клеточной суспензии перенесите 1 мл культивируемого бульона в микрофуговую пробирку объемом 1,5 мл.
2. Центрифугируйте клетки при 6 000 x g в течение 10 минут при 4 °C. Осторожно удалите надосадочную жидкость, не нарушая клеточную гранулу.
3. Добавьте 10 μл реакционного буфера в клеточную гранулу и повторно суспендируйте клетки. Ультразвуком обрабатывайте клеточную суспензию в течение 5 мин. Переложите клеточную суспензию в холодильник на 5 минут.
4. Облучайте клеточную суспензию ультразвуком еще 5 минут.
5. Центрифугируйте клеточную суспензию при 13 000 x g в течение 10 мин при 4 °C. Используйте надосадочную жидкость для тестирования (10 μл).

2. Лакмусовая бумажка

1. В пробирке для микрофуги объемом 1,5 мл предварительно промойте пробирку, добавив и вортексируя 100 мкл реакционного буфера (RB) в пробирке для микрофуги и выбросив буфер.
2. Перенесите 15 μл собранного EC1 в промытую микрофуговую пробирку.
3. Промойте магнитные шарики, поместив микрофуг-пробирку на магнитную решетку. Удалите надосадочную жидкость с помощью пипетирования. Извлеките микрофужную пробирку из штатива, добавьте 100 μл RB и осторожно снова суспендируйте магнитные шарики.
4. Промойте MB еще два раза, повторив шаг 2.3.
5. Поместите микрофугелярную пробирку обратно на магнитный штатив, удалите надосадочную жидкость и добавьте образец E. coli объемом 10 мкл, приготовленный на шаге 1.3.
6. Осторожно перемешайте образец и магнитные шарики, осторожно постукивая по микрофуговой пробирке.
7. Инкубируйте реакцию при комнатной температуре в течение 1 часа.
8. В реакцию добавьте 90 μл ddH₂O и поместите микрофуге-пробирку на магнитный штатив.
9. Примерно через 3 минуты магнитной сепарации осторожно перенесите 85 мкл надосадочной жидкости в пробирку с микрофугой объемом 0,5 мл. Медленно извлекайте надосадочную жидкость, чтобы избежать скопления магнитных шариков.
10. В указанную микропробирку добавить 15 мкл 0,04% фенольного красного и 100 мкл раствора субстрата.
11. Сделайте фотографию через определенные промежутки времени, чтобы зафиксировать изменение цвета.
    заметка: Изменение pH также можно контролировать с помощью рН-метра с микроэлектродом. Начальный pH должен быть примерно 5,2-5,5 (раствор желтого цвета). Если нет, раствор можно скорректировать путем добавления 1 мМ ацетатного буфера pH 5,0).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА)	VWR AMRESCO	105
Гранулы гидроксида натрия (NaOH)	БИО БЕЙСИК КАНАДА ИНК	СБ6789
Трис-база	VWR AMRESCO	497
мочевина	VWR AMRESCO	М123
Ксиленецианол FF	СИГМА-ОЛДРИЧ	Х-4126
0,04% Фенол красный	СИГМА-ОЛДРИЧ	П3532
10x Т4 полинуклеотидкиназный реакционный буфер	Люциген	30061-1
Кишечная палочка K12 (MG1655)	АТКС	ATCC700926
Магнитная бусина (BioMag)	Бэнгс Лабораториз Инк
Магнитная сеперационная стойка	Биолаборатории Новой Англии	С1506С
Микрофуговые пробирки	Сарштедт	72.69
Инкубатор для клеточных культур	Эппендорф Сайентиал	M13520000
Ультразвуковой очиститель Branson	Брэнсон	Н/Д