Репортерный анализ люциферазы для изучения регуляции трансляции в клетках, инфицированных поксвирусом

Аннотация

Источник: Dhungel, P., et al. In Vitro Транскрибированный репортерный анализ люциферазы на основе РНК для изучения регуляции трансляции в клетках, инфицированных поксвирусом. J. Vis. Exp. (2019)

Это видео демонстрирует анализ для изучения регуляции трансляции в клетках, инфицированных поксвирусом. Неинфицированные и инфицированные вирусом клетки котрансфицировали мРНК, кодирующими люциферазу светлячков (Fluc) и Renillaluciferase (Rluc), при этом мРНК Fluc содержала 5'-Poly(A) лидерную последовательность. После добавления биолюминесцентных субстратов на лизированные клетки измерьте сигнал от обеих люцифераз, чтобы определить трансляционное преимущество мРНК Fluc в инфицированных вирусом клетках, обеспечиваемое лидерной последовательностью.

Протокол

1. Трансфектируйте мРНК в клетки

1. Семена клеток HeLa в 24-луночный планшет (на следующий день они должны быть слиты примерно на ~80-90%) и инкубируют в течение ночи в инкубаторе при 37 °C с 5%_CO2.
2. Заражайте клетки HeLa вирусом коровьей оспы (VACV) при кратности инфекции (MOI) 5 или оставляйте неинфицированные клетки HeLa для сравнения.
   заметка: MOI – это количество инфекционных вирусных частиц в клетке.
3. MOI X= {[(Количество клеток * X) / Титр вируса] * 1000} мкл вируса на 1 мл среды.
4. После желаемого h после инфицирования (hpi) (в этом эксперименте при 10-12 hpi) трансфектируйте мРНК (500 нг общей мРНК на лунку 24-луночных планшетов) с использованием катионного реагента для трансфекции липидов, как показано на рисунке 1C.
   1. Для одной лунки 24-луночного планшета смешайте 480 нг мРНК 12A последовательности, содержащей мРНК люциферазы светлячка (12A-Fluc), и 20 нг последовательности Kozak, содержащей мРНК Renilla luciferase (Kozak-Rluc) в одной микроцентрифужной пробирке. В другую микроцентрифужную пробирку добавить 1,1 мкл катионного реагента для трансфекции липидов.
   2. Добавьте 55 мкл восстановленной сывороточной среды в обе пробирки. Перемешать и выдержать при комнатной температуре в течение 5 минут.
   3. Через 5 мин инкубации добавить 55 мкл катионного липидного трансфекционного реагента, содержащего восстановленную сывороточную среду в мРНК-содержащую пробирку.
   4. Осторожно, но тщательно перемешайте и выдерживайте при комнатной температуре в течение 15 минут.
   5. Во время инкубации удалите среду для культивирования клеток и добавьте 400 мкл восстановленной сывороточной среды на лунку 24-луночных планшетов.
   6. После инкубации добавьте 100 мкл смеси по каплям и равномерно в одну лунку из 24-луночных планшетов.

2. Измерение активности люциферазы

1. Через пять часов после совместной трансфекции мРНК 12A-Fluc и Kozak-Rluc измерьте активность люциферазы с помощью системы анализа люциферазы, способной выполнять два репортерных анализа (например, набор для анализа Dual-Luciferase Reporter).
2. Удалите восстановленную сывороточную среду и лизируйте клетки, добавив 150 мкл 1x лизисисного буфера, входящего в набор для анализа люциферазы.
3. После 10-минутной инкубации при комнатной температуре соберите лизат, отбросив клетки, и перенесите их в микроцентрифужную пробирку.
4. Центрифугируйте лизат при 12 000 x g в течение 10 минут при 4 °C до остатков гранулированных клеток.
5. Добавьте 30 мкл надосадочной жидкости в 96-луночный белый аналитический планшет с непрозрачными стенками и твердым дном.
6. Измерьте двойную люминесценцию с помощью набора для анализа люциферазы и люминометра с многорежимным планшетным ридером.
7. Выполните измерение с использованием функции кинетики (для каждой скважины) с настройками, описанными в таблице 1.
   заметка: Показания также можно снять с помощью ручного люминометра. Добавьте в кювету равный объем лизата и субстрата для Fluc. Подождите 2 с и измерьте в течение 10 с с помощью люминометра. После измерения Fluc быстро извлеките кювету из люминометра и вручную добавьте равный объем подложки для Rluc. Снова подождите 2 с и измеряйте в течение 10 секунд с помощью люминометра.
8. Экспортируйте данные считывания люминесценции в файл нужного формата.
9. Определите относительную скорость трансляции мРНК 12A-Fluc в неинфицированных и инфицированных VACV клетках HeLa путем деления значения Fluc на значение Rluc внутреннего контроля.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 2 показан пошаговый анализ исходных данных для получения относительной активности Fluc.

Таблица 1: Настройки измерения люциферазы - шаги для измерения люциферазы с рекомендуемым объемом или временем.

стремянка	Объем/Время
Введите субстрат для анализа люциферазы (fluc):	30 μл
Время ожидания / инкубации:	2 с
Измерение люминесценции (fluc):	10 с
Субстрат Stop & Glo (Rluc):	30 μл
Время ожидания / инкубации:	2 с
Измерение люминесценции (Rluc):	10 с

Результаты

Рисунок 1: Синтез и трансфекция мРНК. (A) Схема транскрипции in vitro. В качестве матрицы используют ДНК, амплифицированную с помощью ПЦР, содержащую ген люциферазы ниже по 5'-UTR и промотор T7. РНК-полимераза Т7 рекрутируется в промотор и добавляет рибонуклеотиды, показанные белым цветом, в направлении от 5' до 3'. Как только длина мРНК достигает 25-30 нт, колпачок m7G доба...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Corning 96 Well Half-Area белый полистирольный микропланшет с плоским дном	Корнинг	No 3693	Непрозрачная стенная 96-луночная белая пластина с твердым дном
Двухлюциферазная репортерная система	Компания Promega	Е1960	Набор для анализа на двойную люциферазу (DLAK)
Микропланшетный люминометр GloMax Navigator	Компания Promega	ГМ2010	Называется многорежимным считывателем пластин, люминометром
Липофектамин 2000	Thermo Fisher Scientific	11668019	Катионный реагент для трансфекции липидов
Opti-MEM	Thermo Fisher Scientific	31985070	Уменьшенное количество сывороточных сред