Метод микротитровальной пластины для оценки минимальной ингибирующей концентрации антибиотика

Аннотация

Источник: Ketelboeter, L. M., et al. Методы ингибирования бактериальной продукции пиомеланина и определения соответствующего повышения чувствительности к окислительному стрессу. J. vis. Exp. (2015).

Это видео демонстрирует метод определения минимальной ингибирующей концентрации (MIC) тестовых антибиотиков против бактерий на основе микротитровой пластины. При добавлении суспензии бактериального патогена Pseudomonas aeruginosa в микротитровальный планшет, содержащий серийные разведения исследуемого антибиотика и ингибитора продукции пиомеланина бактериями, измеряют оптическую плотность лунок для вычисления минимальной ингибирующей концентрации антибиотика и влияния ингибитора продукции пиомеланина на чувствительность бактерий к антибиотикам.

Протокол

1. Анализ минимальной ингибирующей концентрации антибиотика (MIC) в 96-луночных планшетах

1. Создание ночных культур штаммов, подлежащих испытанию в LB (Лурия-Бертани) с NTBC и без него (2-[2-нитро-4-(трифторметил)бензоил]-1,3-циклогександион).
   заметка: Этот протокол описывается с использованием репрезентативного уровня 300 мкМ NTBC.
   1. Добавьте 300 мкМ NTBC к 2 мл LB. Добавьте эквивалентный объем носителя (диметилсульфоксид, ДМСО) к 2 мл LB для состояния без NTBC.
   2. С помощью стерильных зубочисток инокулируйте пробирки одной изолированной колонией бактерий. Для каждого штамма будет одна культура с NTBC и одна культура без NTBC. Инкубировать в течение ночи при температуре 37 °C с аэрацией с помощью ротатора для тканевых культур в воздушном инкубаторе.
2. На следующий день сделайте мастер-решения LB + NTBC и LB + DMSO для настройки анализа MIC. Добавьте NTBC в концентрации 600 μM, так как при добавлении инокулюма он будет разбавлен в два раза, в результате чего конечная концентрация составит 300 μM.
   1. Чтобы проверить один антибиотик на один штамм, добавьте 600 мкМ NTBC к 2 мл LB и перемешайте, чтобы получить главный раствор NTBC. Добавьте эквивалентный объем транспортного средства (ДМСО) к 2 мл LB и перемешайте, чтобы получить основной раствор без NTBC. Используйте эти решения для создания исходных растворов антибиотиков, а также для настройки серии разведения в 96-луночных планшетах.
      заметка: Рецептуры мастер-растворов позволят получить дополнительные решения для учета ошибок пипетирования. Основные решения могут быть увеличены или уменьшены в зависимости от количества тестируемых антибиотиков и штаммов.
3. Приготовьте растворы антибиотиков в главных растворах LB + NTBC или LB + DMSO><. заметка: Концентрация антибиотика в этих растворах должна быть в два раза выше конечной желаемой концентрации. Раствор должен быть достаточным для переноса 100 мкл в четыре лунки в 96-луночном планшете.
   1. Приготовьте исходный раствор гентамицина +/- NTBC в концентрации 64 мкг/мл. Чтобы приготовить этот раствор, добавьте 0,288 мкл запаса гентамицина (100 мг/мл) в 450 мкл LB + NTBC или LB + DMSO master solution.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Максимальная концентрация гентамицина для Pseudomonas aeruginosa PAO1 составляет 32 мкг/мл.
   2. Приготовьте стоковый раствор канамицина +/- NTBC в концентрации 256 мкг/мл. Чтобы приготовить этот раствор, добавьте 3,84 мкл запаса канамицина (30 мг/мл) в 450 мкл LB + NTBC или LB + DMSO master solutions.
      заметка: Максимальная концентрация канамицина для P. aeruginosa PAO1 составляет 128 мкг/мл.
   3. Приготовьте стоковый раствор тобрамицина +/- NTBC в концентрации 8 мкг/мл. Чтобы приготовить этот раствор, добавьте 0,36 мкл запаса тобрамицина (10 мг/мл) в 450 мкл основных растворов LB + NTBC или LB + DMSO><. заметка: Для P. aeruginosa PAO1 максимальная концентрация тобрамицина составляет 4 мкг/мл.
      заметка: Антибиотики и их концентрации могут быть скорректированы в зависимости от тестируемых бактерий.
4. Добавьте по 100 мкл каждого 2-кратного раствора антибиотика в четыре лунки в 96-луночном планшете. Поместите эти растворы в строку А. Например, гентамицин должен быть помещен в А1-А4, канамицин должен быть помещен в А5-А8, а тобрамицин должен быть помещен в А9-А12. На рисунке 1A приведена схема установки 96-луночных планшетов.
   заметка: В одном планшете можно тестировать несколько антибиотиков, но на одном планшете следует тестировать только один штамм, чтобы исключить возможность перекрестного загрязнения другими штаммами.
5. Добавьте 50 μл ведущего раствора LB + NTBC или LB + DMSO в ряды от B до H 96-луночного планшета. Убедитесь, что одна пластина имеет LB + NTBC, а другая пластина — LB + DMSO. Смотрите рисунок 1А.
   1. Используйте LB + NTBC для антибиотиков в LB + NTBC. Используйте LB + DMSO для антибиотиков в LB + DMSO.
6. С помощью микропипетки выполните двукратное последовательное разведение антибиотиков путем переноса 50 мкл раствора из ряда А в ряд В. Смешайте раствор, поменяйте кончики пипеток и перенесите 50 мкл раствора из ряда В в ряд С. Повторите для остальных рядов. После разбавления ряда G удалите 50 мкл раствора из этого ряда и выбросьте. Используйте ряд H в качестве средства контроля роста бактерий без антибиотиков. Смотрите рисунок 1B.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая лунка в рядах от A до G теперь содержит 50 мкл антибиотика в LB + NTBC или LB + DMSO в 2 раза выше конечной желаемой концентрации. Ряд H содержит LB + NTBC или LB + DMSO без антибиотиков.
7. Измерьте наружный диаметр₆₀₀ для ночных культур. Промойте все культуры перед снятием показаний OD₆₀₀, чтобы устранить наличие пиомеланина в среде.
   1. Промойте культуры, центрифугируя 1 мл культуры в микроцентрифуге при давлении 16 000 x g в течение 2 мин. Удалите надосадочную жидкость с помощью микропипеттора и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 1 мл LB.
8. Разбавьте ночные культуры до 2,75x10⁵ КОЕ/мл в фунтах<бр/> заметка: Предположим, что одна единица наружного диаметра₆₀₀ эквивалентна 1x10⁹ КОЕ/мл для P. aeruginosa. Конверсии ОД в КОЕ/мл могут отличаться у других бактерий.
9. Добавьте 50 μл разведенной бактериальной культуры в соответствующую лунку.
   заметка: Культуры, выращенные в NTBC, должны быть добавлены в лунки, содержащие NTBC, а культуры, выращенные в DMSO, должны быть добавлены в лунки, содержащие DMSO. Смотрите рисунок 1B.
   1. Добавьте бактерии в три лунки для каждого штамма и концентрации антибиотика. Добавьте 50 μл LB в четвертую лунку, чтобы он действовал как контроль бактериального загрязнения. Смотрите рисунок 1B.
   2. Используйте многоканальный микропипеттор для инокуляции лунок. При добавлении инокулюма убедитесь, что наконечники пипеток находятся у дна лунок, чтобы предотвратить загрязнение соседних лунок.
      заметка: Добавление бактериальной культуры в лунки приведет к двукратному разбавлению концентраций антибиотиков и NTBC.
10. Накройте 96-луночные планшеты парапленкой и инкубируйте в течение примерно 24 часов при 37 °C. Инкубируйте 96-луночные планшеты статически в воздушном инкубаторе.
11. Осмотрите пластины на предмет роста бактерий в лунках. MIC является самой низкой концентрацией антибиотика, при которой не наблюдается роста бактерий для всех трех реплик каждого штамма.
    1. Визуально осмотрите пластину на предмет роста или прочтите с помощью считывателя пластин, настроенного на наружный диаметр₆₀₀.

Результаты

Рисунок 1: Схема 96-луночного планшета для анализа антибиотиков MIC. (A) 100 мкл 2x антибиотиков самой высокой начальной концентрации находятся в ряду A. Ряды от B до H заполнены 50 мкл либо LB + NTBC, либо LB + DMSO без антибиотиков. (B) В рядах от A до G проводят двойное серийное разведение, в результате чего в каждой лунке вводится 50 мкл разведен...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
2-[2-нитро-4-(трифторметил)бензоил]-1,3-циклогександион (НТБХ)	Сигма-Олдрич	SML0269-50мг	Также называется нитизиноном. Растворим в ДМСО.
Н2О2	Сигма-Олдрич	216763-100МЛ	30 мас.% вH2O. Стабилизированный.
Гентамицин	Биография золота	Г-400-100	Растворим в H2O. Фильтр стерилизовать.
канамицин	Научный центр Фишера	БП906-5	Растворим в H2O. Фильтр стерилизовать.
Тобрамицин	Сигма-Олдрич	Т4014-100МГ	Растворим в H2O. Фильтр стерилизовать.