1. Производство тонких двухслойных полиакриламидных (PA) гидрогелей на многолуночных планшетах
- Производство полиакриламидного гидрогеля
заметка: Смотрите Рисунок 1.
- Для получения гидрогелей перестраиваемой жесткости в пределах от 0,6 кПа до 70 кПа готовят водные растворы, содержащие 3 - 10% от 40% исходного раствора акриламида (см. Таблицу материалов) и 0,06 - 0,6% от 2% исходного раствора бис-акриламида (см. Таблицу материалов). Смотрите таблицу 1.
- Для гидрогелей с концентрацией 0,6 кПа смешайте 3% акриламида с 0,045% бис-акриламида. Для гидрогелей с концентрацией 3 кПа смешайте 5% акриламида с 0,074% бис-акриламида. Для гидрогелей с концентрацией 10 кПа смешайте 10% акриламида с 0,075% бис-акриламида. Для гидрогелей с концентрацией 20 кПа смешайте 8% акриламида с 0,195% бис-акриламида. Для гидрогелей с концентрацией 70 кПа смешайте 10% акриламида с 0,45% бис-акриламида.
ПРИМЕЧАНИЕ: Более подробную информацию о достижении желаемой жесткости гидрогеля PA можно найти в другом месте.
- Приготовьте два водных раствора для каждой желаемой жесткости гидрогеля. Приготовьте раствор 1 без гранул, а раствор 2 — чтобы он содержал 0,03% флуоресцентных микрогранул диаметром 0,1 мкм (см. Таблицу материалов).
- Дегазируйте растворы 1 и 2 с помощью вакуума в течение 15 минут для удаления кислорода, который, как известно, ингибирует полимеризацию растворов.
- Добавьте 0,6% 10 г/мл исходного раствора APS и 0,43% тетраметилэтилендиамина (TEMED) в раствор 1 для начала полимеризации. Действуйте быстро.
- Добавьте 3,6 мкл раствора 1 в центр каждой лунки 24-луночной чашки.
- Немедленно закройте лунки 12-миллиметровыми необработанными круглыми покровными стеклами и дайте раствору 1 постоять 20 минут, чтобы он полностью полимеризовался.
- Аккуратно постучите иглой шприца по поверхности, чтобы на ее кончике появился небольшой крючок, облегчающий снятие покровных стекол. Поднимите покровные стекла с помощью иглы шприца.
- Добавьте 0,6% исходного раствора APS 10 г/мл и 0,43% TEMED в раствор 2. Внесите 2,4 мкл смеси поверх первого слоя в каждую лунку 24-луночной чашки.
- Покройте Solution 2 12-миллиметровыми круглыми стеклянными покровными стеклами, аккуратно надавливая вниз с помощью пары щипцов, чтобы обеспечить минимальную толщину второго слоя. Дайте раствору 2 полимеризоваться в течение 20 минут.
- Добавьте 500 мкл 50 мМ HEPES pH 7,5 в каждую лунку, а затем удалите стеклянные покровные стекла с помощью иглы шприца и щипцов.
- Стерилизация, коллагеновое покрытие и балансировка полиакриламидных гидрогелей
- Подвергните гидрогели воздействию ультрафиолета в течение 1 часа в капюшоне для проведения стерилизации.
- Приготовьте смесь 0,5% масс/объем сульфосукцинимидила 6-(4'-азидо-2'-нитрофениламино)гексаноата (Sulfo-SANPAH, см. Таблицу материалов) в 1% ДМСО и 50 мМ HEPES pH = 7,5.
- Добавьте 200 μL этого раствора на верхнюю поверхность гидрогелей. Действуя быстро, подвергните их воздействию ультрафиолета (302 нм) на 10 минут, чтобы активировать их.
- Промойте гидрогели дважды 1 мл 50 мМ HEPES pH = 7,5. При необходимости повторите, чтобы убедиться, что излишки сшивающего агента удалены.
- Покройте гидрогели белком 200 мкл 0,25 мг/мл коллагена I крысиного хвоста (см. Таблицу материалов) в 50 мМ HEPES. Инкубируйте гидрогели, добавив сверху раствор коллагена, в течение ночи при комнатной температуре.
заметка: Чтобы предотвратить обезвоживание/испарение, поместите многолуночные планшеты во вторичную защитную оболочку и добавьте салфетки для лабораторной очистки, смоченные в воде, на внутренней периферии защитной оболочки.
- Используйте эпифлуоресцентный или конфокальный микроскоп с 40-кратным объективом для измерения толщины гидрогелей. Для этого необходимо определить положения по оси z нижней (где находится поверхность стекла) и верхней плоскости гидрогеля (где интенсивность флуоресцентных шариков максимальна). Затем вычтите z-позиции, чтобы определить высоту.
заметка: Мы использовали инвертированный эпифлуоресцентный микроскоп и объектив с 40-кратным увеличением и числовой апертурой 0,65 для измерения толщины гидрогелей. На этом этапе также могут быть выполнены измерения с помощью атомно-силовой микроскопии (АСМ) для подтверждения точной жесткости гидрогелей (см. Рисунок 2).
- Перед посевом интересующих клеток на гидрогели добавьте 1 мл среды на гидрогели и инкубируйте их при 37 °C в течение от 30 минут до 1 часа><, чтобы обеспечить равновесие.
заметка: Мы добавили полную среду MCDB-131, потому что именно в ней культивировались модельные клетки-хозяева (HMEC-1) (подробнее см. шаг 2.1).
2. Культура микрососудистых эндотелиальных клеток человека и посев на гидрогелях
- Культивирование клеток HMEC-1 (человеческий, микрососудистый эндотелий) в полной среде MCDB-131, содержащей среду MCDB-131 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, 10 нг/мл эпидермального фактора роста, 1 мкг/мл гидрокортизона и 2 мМ L-глутамина (см. Таблицу материалов).
- Разделяйте сливающиеся культуры в соотношении 1:6 каждые 3 - 4 дня и сохраняйте клетки до прохода 40.
- За день до эксперимента отделите клетки от их культурального сосуда, используя 0,25% трипсина/ЭДТА. Сначала промойте клетки и их культуральный сосуд 1x стерильным фосфатным буферным раствором (PBS), а затем добавьте соответствующее количество 0,25% трипсина/ЭДТА (2 мл на 100-мм чашку или 75-сантиметровую колбу, 1 мл на 60-миллиметровую чашку или 25-сантиметровую колбу), инкубируя колбу при 37 °C в течение 5-10 минут, чтобы обеспечить отделение клеток от их субстрата.
- Нейтрализуйте трипсин, добавив желаемый объем полной среды MCDB-131, аккуратно пипетируйте, чтобы разбить скопления клеток, а затем поместите раствор в коническую центрифужную пробирку.
- Аккуратно взболтайте раствор клеток, чтобы убедиться, что клетки равномерно распределены, а затем выньте 20 μL раствора и очень аккуратно заполните две камеры под покровным стеклом стеклянного гемоцитометра.
- Раствор клеток, содержащихся в конической центрифужной пробирке, с помощью центрифугирования в течение 10 мин при 500 x g.
- В течение 10-минутного периода ожидания подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра. Используйте микроскоп, сосредоточьтесь на линиях сетки гемоцитометра с 10-кратным объективом, а затем используйте ручной счетчик для подсчета количества клеток в одном квадрате размером 1 мм х 1 мм.
- Переместите гемоцитометр на другой квадрат размером 1 мм х 1 мм, посчитайте там клетки, а затем повторите процесс еще два раза. Рассчитайте среднее значение четырех измерений, а затем умножьте среднее значение на 104. Конечным значением является количество жизнеспособных клеток/мл в центрифугируемой суспензии клеток.
- Удалите жидкость из конической центрифужной трубки, следя за тем, чтобы гранула элемента не была повреждена. Ресуспендируйте клетки в полной среде MCDB-131 в концентрации 4 x 105 клеток/мл.
- Засейте клетки в суспензии на гидрогелях, сначала удалив среду, с которой инкубировались гидрогели, а затем добавив 1 мл клеточной суспензии на каждый гидрогель.
3. Инфицирование микрососудистых эндотелиальных клеток человека L. monocytogenes
- За три дня до заражения вынесите штамм Lm для использования из запасов глицерина (хранящихся при -80 °C) на планшет BHI-агара, который содержит 7,5 г/мл хлорамфеникола и 200 г/мл стрептомицина, если это необходимо><.
заметка: Выделяемый штамм может быть диким или мутантным, конститутивно экспрессирующим флуоресценцию (для иммуноокрашивания JAT1045 использовали) или экспрессирующим флуоресценцию под действием промотора ActA (для проточной цитометрии или микроскопии тракционной силы использовали JAT983 или JAT985).
- Инкубируйте планшеты при температуре 37 °C до образования дискретных колоний (1 - 2 дня).
- За день до заражения вырастите нужный штамм в течение ночи, встряхивая его при 150 об/мин при 30 °C в среде BHI с содержанием хлорамфеникола 7,5 мкг/мл (при необходимости).
- Поместите 5 мл среды BHI в коническую центрифужную пробирку объемом 15 мл, добавьте 7,5 мкг/мл хлорамфеникола (если это необходимо), а затем инокулируйте одну колонию из агаровой пластины с помощью стерильного наконечника объемом 10 мкл.
- На следующий день, непосредственно перед заражением, измерьте оптическую плотность бактериального раствора при длине волны 600 нм (OD600), разбавив образец в соотношении 1:5; используйте кювету, содержащую только BHI, в качестве заготовки.
- Разбавьте ночную культуру до OD600 0,1 и инкубируйте ее, встряхивая в течение 2 ч при 30 °C, в среде BHI с 7,5 мкг/мл хлорамфеникола (если это необходимо), чтобы позволить бактериям достичь логарифмического роста.
- Измерьте OD600 бактериального раствора, который, как ожидается, составит около 0,2 - 0,3. Если OD600 выше, разбавьте его до 0,2 - 0,3 только BHI.
- Возьмите 1 мл бактериального раствора в микроцентрифужную пробирку. Открутите его в течение 4 минут при температуре 2 000 x g с помощью центрифугирования при комнатной температуре. Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте бактериальную гранулу в 1 мл PBS для культуры тканей в капюшоне для культуры тканей. Промойте бактерии еще дважды, отжимая их в течение 4 минут при температуре 2000 x g при комнатной температуре. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте бактерии в 1 мл PBS.
- Приготовьте инфекционную смесь, смешав 10 или 50 мкл бактерий, ресуспендированных в PBS, с 1 мл полной среды MCDB-131 для множественного распространения инфекции (MOI; т.е. количество бактерий на клетку-хозяина) приблизительно 50 бактерий на клетку-хозяина или 10 бактерий на клетку-хозяина.
- Удалите среду из лунок 24-луночных планшетов, осторожно, чтобы не повредить гидрогели или клетки. Промойте клетки 1 раз 1 мл полной среды MCDB-131, а затем добавьте по 1 мл бактерий в каждую лунку.
- Накройте тарелку крышкой и оберните тарелки полиэтиленовой пищевой пленкой, чтобы избежать протекания. Поместите планшеты в центрифугу и вращайте образцы в течение 10 минут при 200 x g, чтобы синхронизировать вторжение. Переместите планшеты в инкубатор для тканевых культур и инкубируйте их в течение 30 минут при температуре 37 °C.
- Промойте образцы 4 раза с помощью полной среды MCDB-131 и переместите их в инкубатор для культуры тканей. Еще через 30 минут замените среду средой с добавлением гентамицина в концентрации 20 мкг/мл.
4. Проточная цитометрия для количественной оценки чувствительности клеток хозяина к инфекции, зависящей от жесткости внеклеточного матрикса
- Взвесьте 5 мг коллагеназы и поместите ее в коническую центрифужную пробирку объемом 15 мл. Добавьте 10 мл 0,25% трипсина-ЭДТА и хорошо перемешайте.
- Через 8 ч после заражения удалить среду из лунок 24-луночного планшета и 1x промыть лунки тканевой культурой PBS. Извлеките PBS из лунок и добавьте в каждую лунку по 200 мкл смеси трипсин-ЭДТА/коллагеназы. Поместите его в инкубатор для культуры тканей на 10 минут, чтобы обеспечить полную отслойку клеток.
- Используйте свежую пипетку для каждой лунки и передавайте смесь вверх и вниз по 8 раз. Будьте осторожны, чтобы не повредить клетки. Добавьте 200 мкл полной среды в каждую лунку, чтобы нейтрализовать трипсин.
- Перелейте 400-мкловый раствор каждой лунки в полистирольную пробирку объемом 5 мл с крышкой сетчатого фильтра 35 мкм (см. Таблицу материалов).
- Анализируйте 10 000 - 20 000 клеток в образце с помощью проточной цитометрии. Выполняйте сбор данных с помощью проточной цитометрии и определяйте процент инфицированных клеток в лунке с помощью соответствующего коммерчески доступного программного обеспечения. Используйте диаграммы прямого рассеяния и бокового рассеяния, чтобы определить основную часть распределения счетчиков ячеек.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это обеспечит анализ отдельных клеток и исключит мусор или дублеты или триплеты клеток.
- Измерьте сигнал флуоресценции от контрольных неинфицированных клеток и определите популяцию инфицированных клеток без учета аутофлуоресценции.
Таблица 1. Состав полиакриламидных (ПА) гидрогелей различной жесткости. В данной таблице процентное содержание 40% раствора акриламида и процентное содержание 2% раствора бис-акриламида для достижения заданной жесткости (модуль Юнга, Е) указаны в разных столбцах.
| Модуль Юнга (E, кПа) | Акриламид % (от 40% поголовья) | Бисакриламид % (от 2% запасов) |
| 0,6 | 3 | 0,045 |
| 3 | 5 | 0,075 |
| 10 | 10 | 0,075 |
| 20 | 8 | 0,195 |
| 70 | 10 | 0,45 |
