Количественная покадровая микроскопия для оценки бактериальной диссеминации, зависящей от жесткости внеклеточного матрикса

Abstract

Источник: Bastounis, E. E. et al., Анализ на основе полиакриламида в многолуночном формате для изучения влияния жесткости внеклеточного матрикса на бактериальную инфекцию адгезивных клеток. J. Vis. Exp.(2018)

Это видео демонстрирует количественную покадровую микроскопию для оценки распространения Listeria monocytogenes через эндотелиальные клетки, зависящей от жесткости внеклеточного матрикса. Более мягкий гидрогель способствует более быстрой диссеминации бактерий через эндотелиальные клетки по сравнению с более жесткими аналогами, подчеркивая влияние жесткости матрикса на распространение бактерий.

Protocol

1. Производство тонких двухслойных полиакриламидных (PA) гидрогелей на многолуночных планшетах

1. Растворите персульфат аммония (APS) в дистиллированной сверхчистой воде до конечной концентрации 10 г/мл. Аликвотировать и хранить раствор при температуре 4 °C для кратковременного применения (3 недели). <бр/> ПРИМЕЧАНИЕ: Вышеуказанный раствор может быть приготовлен до изготовления гидрогеля.
2. Активация стекла 24-луночных посуды
   1. Инкубировать 24-луночные стеклянные донные планшеты с лунками диаметром 13 мм (см. Таблицу материалов) в течение 1 ч с 500 мкл 2 М гидроксида натрия (NaOH) на лунку при комнатной температуре.
   2. Промойте лунки 1 раз сверхчистой водой, а затем добавьте 500 мкл 2% (3-аминопропил) триэтоксисилана (см. Таблицу материалов) в 95% этаноле в каждую лунку на 5 минут.
   3. Еще раз промойте лунки водой 1 раз и добавьте 500 мкл 0,5% глутаральдегида в каждую лунку в течение 30 мин. Промойте лунки 1 раз водой и высушите их при 60 °C при снятой крышке.
3. Производство полиакриламидного гидрогеля
   ПРИМЕЧАНИЕ: Смотрите Рисунок 1.
   1. Для получения гидрогелей перестраиваемой жесткости в пределах от 0,6 кПа до 70 кПа готовят водные растворы, содержащие 3 - 10% от 40% исходного раствора акриламида (см. Таблицу материалов) и 0,06 - 0,6% от 2% исходного раствора бис-акриламида (см. Таблицу материалов). Смотрите таблицу 1.
      1. Для гидрогелей с концентрацией 0,6 кПа смешайте 3% акриламида с 0,045% бис-акриламида. Для гидрогелей с концентрацией 3 кПа смешайте 5% акриламида с 0,074% бис-акриламида. Для гидрогелей с концентрацией 10 кПа смешайте 10% акриламида с 0,075% бис-акриламида. Для гидрогелей с концентрацией 20 кПа смешайте 8% акриламида с 0,195% бис-акриламида. Для гидрогелей с концентрацией 70 кПа смешайте 10% акриламида с 0,45% бис-акриламида. <бр/> ПРИМЕЧАНИЕ: Более подробную информацию о достижении желаемой жесткости гидрогеля PA можно найти в другом месте.
   2. Приготовьте два водных раствора для каждой желаемой жесткости гидрогеля. Приготовьте раствор 1 без гранул, а раствор 2 — чтобы он содержал 0,03% флуоресцентных микрогранул диаметром 0,1 мкм (см. Таблицу материалов).
   3. Дегазируйте растворы 1 и 2 с помощью вакуума в течение 15 минут для удаления кислорода, который, как известно, ингибирует полимеризацию растворов.
   4. Добавьте 0,6% 10 г/мл исходного раствора APS и 0,43% тетраметилэтилендиамина (TEMED) в раствор 1 для начала полимеризации. Действуйте быстро.
   5. Добавьте по 3,6 мкл раствора 1 в центр каждой лунки чашки на 24 лунки (см. шаг 1.2 для его приготовления).
   6. Немедленно закройте лунки 12-миллиметровыми необработанными круглыми покровными стеклами и дайте раствору 1 постоять 20 минут, чтобы он полностью полимеризовался.
   7. Аккуратно постучите иглой шприца по поверхности, чтобы на ее кончике появился небольшой крючок, облегчающий снятие покровных стекол. Поднимите покровные стекла с помощью иглы шприца.
   8. Добавьте 0,6% исходного раствора APS 10 г/мл и 0,43% TEMED в раствор 2. Внесите 2,4 мкл смеси поверх первого слоя в каждую лунку 24-луночной чашки.
   9. Покройте Solution 2 12-миллиметровыми круглыми стеклянными покровными стеклами, аккуратно надавливая вниз с помощью пары щипцов, чтобы обеспечить минимальную толщину второго слоя. Дайте раствору 2 полимеризоваться в течение 20 минут.
   10. Добавьте 500 мкл 50 мМ 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазиэтансульфоновой кислоты (HEPES) pH 7,5 в каждую из лунок, а затем удалите стеклянные покровные стекла с помощью иглы шприца и щипцов.
4. Стерилизация, коллагеновое покрытие и балансировка полиакриламидных гидрогелей
   1. Подвергните гидрогели воздействию ультрафиолета в течение 1 часа в капюшоне для проведения стерилизации.
   2. Приготовьте смесь 0,5% масс/объем сульфосукцинимидила 6-(4'-азидо-2'-нитрофениламино)гексаноата (Sulfo-SANPAH, см. Таблицу материалов) в 1% диметилсульфоксиде (ДМСО) и 50 мМ HEPES pH = 7,5.
   3. Добавьте 200 μL этого раствора на верхнюю поверхность гидрогелей. Действуя быстро, подвергните их воздействию ультрафиолета (302 нм) на 10 минут, чтобы активировать их.
   4. Промойте гидрогели дважды 1 мл 50 мМ HEPES pH = 7,5. При необходимости повторите, чтобы убедиться, что излишки сшивающего агента удалены.
   5. Покройте гидрогели белком 200 мкл 0,25 мг/мл коллагена I крысиного хвоста (см. Таблицу материалов) в 50 мМ HEPES. Инкубируйте гидрогели, добавив сверху раствор коллагена, в течение ночи при комнатной температуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы предотвратить обезвоживание/испарение, поместите многолуночные планшеты во вторичную защитную оболочку и добавьте салфетки для лабораторной очистки, смоченные в воде, на внутренней периферии защитной оболочки.
   6. Используйте эпифлуоресцентный или конфокальный микроскоп с 40-кратным объективом для измерения толщины гидрогелей. Для этого необходимо определить положения по оси z нижней (где находится поверхность стекла) и верхней плоскости гидрогеля (где интенсивность флуоресцентных шариков максимальна). Затем вычтите z-позиции, чтобы определить высоту.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мы использовали инвертированный эпифлуоресцентный микроскоп и объектив с 40-кратным увеличением и числовой апертурой 0,65 для измерения толщины гидрогелей. На этом этапе также могут быть выполнены измерения с помощью атомно-силовой микроскопии (АСМ) для подтверждения точной жесткости гидрогелей (см. Рисунок 2).
   7. Перед посевом интересующих клеток на гидрогели добавьте 1 мл среды на гидрогели и инкубируйте их при 37 °C в течение от 30 минут до 1 часа><, чтобы обеспечить равновесие. ПРИМЕЧАНИЕ: Мы добавили полную среду MCDB-131, потому что именно в ней культивировались клетки модели хозяина (HMEC-1) (подробнее см. шаг 2.1).

2. Культура микрососудистых эндотелиальных клеток человека и посев на гидрогелях

1. Культивирование клеток HMEC-1 (человеческий, микрососудистый эндотелий) в полной среде MCDB-131, содержащей среду MCDB-131 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, 10 нг/мл эпидермального фактора роста, 1 мкг/мл гидрокортизона и 2 мМ L-глутамина (см. Таблицу материалов).
2. Разделяйте сливающиеся культуры в соотношении 1:6 каждые 3-4 дня и сохраняйте клетки до прохода 40.
3. За день до эксперимента отделите клетки от их культурального сосуда, используя 0,25% трипсина/ЭДТА. Сначала промойте клетки и их культуральный сосуд 1x стерильным фосфатным буферным раствором (PBS), а затем добавьте соответствующее количество 0,25% трипсина/ЭДТА (2 мл на 100-мм чашку или 75-сантиметровую колбу, 1 мл на 60-миллиметровую чашку или 25-сантиметровую колбу), инкубируя колбу при 37 °C в течение 5-10 минут, чтобы обеспечить отделение клеток от их субстрата.
4. Нейтрализуйте трипсин, добавив желаемый объем полной среды MCDB-131, аккуратно пипетируйте, чтобы разбить скопления клеток, а затем поместите раствор в коническую центрифужную пробирку.
5. Аккуратно взболтайте раствор клеток, чтобы убедиться, что клетки равномерно распределены, а затем выньте 20 μL раствора и очень аккуратно заполните две камеры под покровным стеклом стеклянного гемоцитометра.
6. Раствор клеток, содержащихся в конической центрифужной пробирке, с помощью центрифугирования в течение 10 мин при 500 x g.
7. В течение 10-минутного периода ожидания подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра. Используйте микроскоп, сосредоточьтесь на линиях сетки гемоцитометра с 10-кратным объективом, а затем используйте ручной счетчик для подсчета количества клеток в одном квадрате размером 1 мм х 1 мм.
8. Переместите гемоцитометр на другой квадрат размером 1 мм х 1 мм, посчитайте там клетки, а затем повторите процесс еще два раза. Рассчитайте среднее значение четырех измерений, а затем умножьте среднее значение на 10⁴. Конечным значением является количество жизнеспособных клеток/мл в центрифугируемой суспензии клеток.
9. Удалите жидкость из конической центрифужной трубки, следя за тем, чтобы гранула элемента не была повреждена. Ресуспендируйте клетки в полной среде MCDB-131 в концентрации 4 x 10⁵ клеток/мл.
10. Засейте клетки в суспензии на гидрогелях, сначала удалив среду, с которой инкубировались гидрогели, а затем добавив 1 мл клеточной суспензии на каждый гидрогель.

3. Инфицирование микрососудистых эндотелиальных клеток человека Listeria monocytogenes (Lm)

1. Предварительная подготовка
   ПРИМЕЧАНИЕ: Заранее приготовьте следующие растворы.
   1. Запасы стрептомицина, левомицетина и гентамицина
      1. Приготовьте 50 мг/мл стоковых растворов стрептомицина, массируя 0,5 г стрептомицина сульфата и полностью растворив его в 10 мл ультрачистой воды.
      2. Приготовьте 7,5 мг/мл стоковых растворов хлорамфеникола массой 75 мг и полностью растворив его в 10 мл 100% этанола.
      3. Приготовьте 20 мг/мл стоковых растворов гентамицина, массируя 0,2 г сульфата гентамицина и полностью растворив его в 10 мл ультрачистой воды.
      4. Все исходные растворы отфильтровать и стерилизовать шприцевым фильтром 0,2 мкм и хранить при температуре -20 °С для длительного использования (1 - 2 месяца).
   2. Инфузионные среды для мозга и сердца (BHI) и агаровые пластины
      1. Найдите две колбы объемом 1 л и добавьте в каждую из них магнитную мешалку.
      2. Для среды BHI добавьте 37 г порошка BHI в одну колбу и добавьте сверхчистую воду до 1 л. Энергично перемешайте раствор, поместив колбу на магнитную пластину для перемешивания до полного растворения порошка.
      3. Для пластин с агаром BHI добавьте 37 г порошка BHI и 15 г гранулированного агара (см. Таблицу материалов) во вторую колбу и добавьте сверхчистую воду до 1 л. Энергично перемешайте раствор, поместив колбу на магнитную пластину для перемешивания до полного растворения порошка.
      4. Закрутите крышки колб не слишком плотно и автоклавируйте растворы с настройкой жидкости или в соответствии с техническими условиями автоклава.
      5. Извлеките раствор из автоклава, затем охладите раствор агар-BHI до 55 °C. Если среда BHI в колбе объемом 1 л хранится стерильной, ее можно использовать до месяца.
      6. Чтобы приготовить бактериальные агар-BHI планшеты, сначала добавьте антибиотики, если это необходимо, в колбу, содержащую BHI и агар (в зависимости от штаммов бактерий, которые будут выращиваться). Ненадолго поместите колбу на магнитную пластину для быстрого перемешивания.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Используемые здесь антибиотики специфичны для используемых штаммов Lm, но любые необходимые антибиотики могут быть использованы в планшетах BHI-агара. Мы добавили стрептомицин в концентрации 200 мкг/мл и хлорамфеникол в концентрацию 7,5 мкг/мл, поскольку штаммы 10403S Lm устойчивы к стрептомицину. Эти штаммы были конъюгированы с плазмидой, содержащей открытую считывающую рамку хлорамфениколацетилтрансферазы, отсюда и устойчивость к хлорамфениколу.
      7. Разлейте смесь в 10-сантиметровые планшеты для культивирования бактерий из полистирола (примерно по 20 мл на пластину). Чтобы избавиться от пузырей, кратковременно прокалите верхнюю поверхность пластин. Остудите тарелки на ночь при комнатной температуре.
      8. На следующий день запечатайте сухие пластины и храните их при температуре 4 °C.
2. Инфицирование клеток микрососудистого эндотелия человека L. monocytogenes
   1. За три дня до заражения вынесите штамм Lm для использования из запасов глицерина (хранящихся при -80 °C) на планшет BHI-агара, который содержит 7,5 г/мл хлорамфеникола и 200 г/мл стрептомицина, если это необходимо><. ПРИМЕЧАНИЕ: Штамм, подлежащий выделению, может быть диким или мутантным, конститутивно экспрессирующим флуоресценцию (для иммуноокрашивания JAT1045 использовали) или экспрессирующим флуоресценцию под действием промотора ActA (для проточной цитометрии или микроскопии тракционной силы использовали JAT983 или JAT985).
   2. Инкубируйте планшеты при температуре 37 °C до образования дискретных колоний (1 - 2 дня).
   3. За день до заражения вырастите нужный штамм в течение ночи, встряхивая его при 150 об/мин при 30 °C в среде BHI с содержанием хлорамфеникола 7,5 мкг/мл (при необходимости).
      1. Поместите 5 мл среды BHI в коническую центрифужную пробирку объемом 15 мл, добавьте 7,5 мкг/мл хлорамфеникола (если это необходимо), а затем инокулируйте одну колонию из агаровой пластины с помощью стерильного наконечника объемом 10 мкл.
   4. На следующий день, непосредственно перед заражением, измерьте оптическую плотность бактериального раствора при длине волны 600 нм (OD600), разбавив образец в соотношении 1:5; используйте кювету, содержащую только BHI, в качестве заготовки.
   5. Разбавьте ночную культуру до OD600 0,1 и инкубируйте ее, встряхивая в течение 2 ч при 30 °C, в среде BHI с 7,5 мкг/мл хлорамфеникола (если это необходимо), чтобы позволить бактериям достичь логарифмического роста.
   6. Измерьте OD600 бактериального раствора, который, как ожидается, составит около 0,2-0,3. Если OD600 выше, разбавьте его до 0,2 - 0,3 только BHI.
   7. Возьмите 1 мл бактериального раствора в микроцентрифужную пробирку. Открутите его в течение 4 минут при температуре 2 000 x g с помощью центрифугирования при комнатной температуре. Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте бактериальную гранулу в 1 мл PBS для культуры тканей в капюшоне для культуры тканей. Промойте бактерии еще дважды, отжимая их в течение 4 минут при температуре 2000 x g при комнатной температуре. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте бактерии в 1 мл PBS.
   8. Приготовьте инфекционную смесь, смешав 10 или 50 мкл бактерий, ресуспендированных в PBS, с 1 мл полной среды MCDB-131 для множественного распространения инфекции (MOI; т.е. количество бактерий на клетку-хозяина) приблизительно 50 бактерий на клетку-хозяина или 10 бактерий на клетку-хозяина.
   9. Удалите среду из лунок 24-луночных планшетов, осторожно, чтобы не повредить гидрогели или клетки. Промойте клетки 1 раз 1 мл полной среды MCDB-131, а затем добавьте по 1 мл бактерий в каждую лунку.
   10. Оставьте некоторое количество инфекционной смеси (не менее 100 мкл) для определения MOI (см. шаг 3.3).
   11. Накройте тарелку крышкой и оберните тарелки полиэтиленовой пищевой пленкой, чтобы избежать протекания. Поместите планшеты в центрифугу и вращайте образцы в течение 10 минут при 200 x g, чтобы синхронизировать вторжение. Переместите планшеты в инкубатор для тканевых культур и инкубируйте их в течение 30 минут при температуре 37 °C.
   12. Промойте образцы 4 раза с помощью полной среды MCDB-131 и переместите их в инкубатор для культуры тканей. Еще через 30 минут замените среду средой с добавлением гентамицина в концентрации 20 мкг/мл.
3. Определение множественности инфекции (MOI)
   1. Во время начальной 30-минутной инкубации клеток-хозяев с бактериями приготовьте 10-кратные серийные разведения инфекционной смеси для определения MOI. Сделайте 10-кратное разведение, смешав 100 мкл инфекционной смеси с 900 мкл 1x PBS (^10-1 разведение). Затем смешайте 100 мкл разведения ^10-1 с 900 мкл PBS (разведение ^10-2).
   2. Продолжайте до тех пор, пока не получится разведение ^10-5.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все растворы необходимо хорошо перемешать перед их разбавлением, и на каждом этапе следует использовать свежие чистые наконечники для пипетки.
   3. После того, как разведения будут произведены, поместите 100 мкл из ^10-2 - ^10-5 разведений в центр пластин BHI/агара/хлорамфеникола/стрептомицина (если это необходимо).
   4. Сделайте разбрасыватель из стеклянной пипетки, согнув пипетку с помощью огня, чтобы получился крючок. Окуните пипетку в 100% этанол для стерилизации, а затем сожгите этанол пламенем.
   5. Как только разбрасыватель остынет, равномерно распределите бактериальные разведения по пластинам, начиная с разведения ^10-5 и переходя к более концентрированным смесям. Выдерживайте пластины вверх дном при температуре 37 °C в течение 2 дней.
   6. В зависимости от плотности колоний определите количество колоний либо ^10-3 и ^10-4, либо ^10-4 и ^10-5 разбавляющих пластин. Рассчитайте MOI следующим образом:
      количество колоний × коэффициент разведения ÷ первоначально добавленный объем = количество колониеобразующей единицы (КОЕ) на мкл
      количество КОЕ на мкл × объем бактериальной смеси на лунку = количество КОЕ на лунку <бр/> количество КОЕ на лунку × объем клеток на лунку = количество бактерий на клетку
      ПРИМЕЧАНИЕ: КОЕ расшифровывается как колониеобразующие единицы.
   7. Усредните MOI с двух пластин, чтобы получить окончательные MOI.

4. Количественная покадровая микроскопия для оценки жесткости внеклеточного матрикса

Приготовьте гидрогели PA на 24-луночном планшете (см. шаг 1), засейте клетки HMEC-1 (см. шаг 2) и вырастите в течение ночи культуры JAT983, как описано выше (см. шаг 3).

1. В день заражения приготовьте инфекционную смесь, смешав 10 μл бактериальной гранулы на мл полной среды MCDB-131. Осторожно удалите среду из лунок 24-луночных планшетов и добавьте в каждую лунку 1,9 мл полной среды MCDB-131 и 0,1 мл бактериальной смеси.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Более низкий MOI, используемый в этом анализе, необходим для анализа событий распространения, которые начинаются с проникновения одной бактерии в клетку-хозяина.
2. Накройте тарелку крышкой и запечатайте полиэтиленовой пленкой, чтобы избежать протекания. Поместите планшеты в центрифугу и вращайте образцы в течение 10 минут при 200 x g, чтобы синхронизировать вторжение.
3. Переместите планшеты в инкубатор для тканевых культур и инкубируйте их в течение 5 минут.
4. Промойте образцы 4 раза с помощью среды и переместите их в инкубатор для тканевых культур. Через 5 - 7 минут замените среду средой с добавлением 20 мкг/мл гентамицина.
5. Инкубируйте планшет в инкубаторе в течение дополнительных 5 часов, чтобы позволить промотору actA включиться и управлять экспрессией открытой рамки считывания mTagRFP.
6. Приготовьте среду для живой микроскопии, добавив L-15 Лейбовица с 10% фетальной бычьей сывороткой, 10 нг/мл эпидермального фактора роста и 1 мкг/мл гидрокортизона.
   ПРИМЕЧАНИЕ: L-15 уже содержит 2 мМ L-глутамина, поэтому нет необходимости добавлять его дополнительно, как в случае с MCDB-131.
7. Смешайте 1 мкл 1 мг/мл красителя Hoechst с 1 мл полной среды L-15 и добавьте его в каждую лунку, чтобы окрашивать ядра клеток. Поместите клетки в инкубатор для тканевых культур на 10 минут, а затем замените в каждой лунке полную среду L-15 на 1 мл полной среды L-15 с добавлением 20 мкг/мл гентамицина. Накройте пластину крышкой и поместите ее в климатическую камеру микроскопа (см. Таблицу материалов), уравновешенную до 37 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для визуализации использовали инвертированный эпифлуоресцентный микроскоп с ПЗС-камерой (см. Таблицу материалов) и флюоритовый воздушный объектив с 20-кратным воздушным планом и 0,75 NA. Мощность была установлена на 50%, а время экспозиции — на 50 мс. Фильтры микроскопа, используемые для mCherry, имеют длину волнения и излучения 470/525 нм соответственно.
8. Визуализируйте несколько позиций каждые 5 минут с помощью функции автофокусировки для отслеживания того, как Lm распространяется через монослои HMEC-1, засеянные гидрогелями различной жесткости.
   ПРИМЕЧАНИЕ: L-15 буферизируется с помощью HEPES, поэтому нет необходимости использовать CO₂ во время визуализации.

Таблица 1. Состав полиакриламидных (ПА) гидрогелей различной жесткости. В данной таблице процентное содержание 40% раствора акриламида и процентное содержание 2% раствора бис-акриламида для достижения заданной жесткости (модуль Юнга, Е) указаны в разных столбцах.

Модуль Юнга (E, кПа)	Акриламид % (от 40% поголовья)	Бисакриламид % (от 2% запасов)
0,6	3	0,045
3	5	0,075
10	10	0,075
20	8	0,195
70	10	0,45

Results

Рисунок 1: Анализ бактериальной инфекции клеток хозяина, проживающих на тонких двухслойных флуоресцентных гранулах полиакриламида (ПА) гидрогелей различной жесткости.Стеклянные покровные стекла химически модифицированы для обеспечения прилипания гидрогеля. B. 3,6 мкл смеси PA осаждается на стеклянные днища. C. C. Смесь накрывается круглым стеклянным покровным стеклом...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Реагентов
Гранулы гидроксида натрия	рыбак	С318-500
(3-аминопропил)триэтоксисилан	сигма	А3648
25% глютеральдегид	сигма	Г6257-100МЛ
40% Акриламид	сигма	А4058-100МЛ
Раствор бис-акриламида (2% мас./об.)	Научный центр Фишера	БП1404-250
Персульфат аммония	рыбак	BP17925
ТЕМЕД	сигма	Т9281-25МЛ
Сульфо-САНПА	Протеохем	С1111-100мг
Коллаген, раствор типа I от крыс	сигма	С3867-1ВЛ
Диметилсульфоксид (ДМСО)	Джей Ти Бейкер	9224-01
HEPES, Свободная кислота	Джей Ти Бейкер	4018-04
L-15 Лейбовица средний, без фенола красного	Термофишер	21083027
MCDB 131 Средний, без глютамина	Технологии жизни	10372019
Тональный крем Фетальная бычья сыворотка, Лот: A37C48A	Джемини Био-Прод	900108 500мл
Эпидермальный фактор роста, EGF	сигма	Е9644
гидрокортизон	сигма	Н0888
L-глютамин 200 мМ	рыбак	SH3003401
ДПБС 1Х	рыбак	SH30028FS
Гентамицина сульфат	МП биомедицина	No 194530
Хлорамфеникол	сигма	С0378-5Г
Агар DifcoTM, гранулированный	БД	No 214530
BBL TM Инфузия мозга и сердца	БД	211059
Hoechst 33342, тригидрохлорид, тригидрат - 10 мг/мкл раствор в воде	Инвитроген	Н3570
0,25% трипсин-ЭДТА, фенол красный	Термофишер	25200056
Стрептомицина сульфат	Научный центр Фишера	3810-74-0 (Английский)
Одноразовое лабораторное оборудование
Круглые стеклянные покровные стекла 12 мм	Фишербранд	Тел.: 12-545-81	No. 1.5 Покровное стекло | 10 мм Диаметр стекла | Без покрытия
Стеклянное дно 24 луночных пластин	Маттек	П24Г-1.5-13-Ф
Фляги Т-25	сокол	353118
Конические тубы 50 мл	сокол	No 352070 (Английский
Конические тубы 15 мл	сокол	352196
Одноразовые серологические пипетки (1 мл, 2 мл, 5 мл, 10 мл, 25 мл)	сокол	357551
Стеклянные пипетки Пастера	ВВР	14672-380
Наконечники для пипеток (1-200 μл, 101-1000 μл)	Денвилл	П1122, П1126
Неопудренные смотровые перчатки	Микрофлекс	ХС-310
Кюветы бактерии	Сарштедт	Тел.: 67.746
Бритвы	ВВР	55411-050
Игла для шприца	БД	305167
0,2 мкм стерилизующие бутылки	Термо Сайентиал	566-0020
Шприцы 20 мл	БД	No 302830
Фильтры 0,2 мкм	Термо Сайентиал	723-2520
деревянные палочки	Грейнджер	42181501
пищевая плёнка	Санта Крус Биотехнологии	СК-3687
Пластины бактерий	сокол	351029
Крупногабаритное/одноразовое лабораторное оборудование
Капюшон для культивирования тканей	пекарь	ИК504
Гемацитометр	сигма	Z359629
Бактериальный инкубатор	Термо Сайентиал	ИГС180
Инкубатор для тканевых культур	НуАйре	НУ-8700
Вакуумная камера/дегазатор	Беларт	42025	37 °C и 5% CO2
Инвертированный эпифлуоресцентный микроскоп Nikon Diaphot 200	Компания Nikon	НИКОН-ДИАФОТ-200
Клеточный инкубатор	Хейсон	обычай
Вспомогательное средство для пипетки	Драммонд	4-000-110
Пипетки (10 μл, 200 μл, 1000 мкл)	Гилсон	F144802, F123601, F123602
pH-метр	Mettler Toledo	30019028
щипцы	ФСТ	11000-12
Колба объемом 1 л	Фишербранд	FB5011000
Автоклавная машина	Амско	3021
Магнитная пластина для перемешивания	Беллко	7760-06000
Магнитные мешалки	Беллко	1975-00100
спектрофотометр	Бэкмен	ДУ 640
программное обеспечение
Программное обеспечение для микроскопа (μManager)	Открыть работу с изображениями
Матлаб	Матлаб Инк
Флоуджо	ООО «ФлоуДжо»
Программное обеспечение для автоматизированного анализа изображений, CellC	https://sites.google.com/site/cellcsoftware/		Программное обеспечение находится в свободном доступе. Исполняемые файлы и исходные коды MATLAB можно получить на https://sites.google.com/site/cellcsoftware/