Определение противовирусной эффективности экспериментальных препаратов с помощью анализа бляшек

Аннотация

Источник: Yadavalli, T., et al. Эксплант ткани роговицы свиньи для изучения эффективности противовирусных препаратов против вируса простого герпеса-1. J. Vis. Exp. (2021)

Это видео демонстрирует метод проведения анализа бляшек с использованием вируса, полученного из инфицированной роговицы свиней. Роговица свиньи используется для проверки противовирусной эффективности экспериментальных препаратов.

Протокол

1. Количественная оценка вирусной инфекции

ПРИМЕЧАНИЕ: Титры вирусов из роговицы свиней следует оценивать каждый день, чтобы проанализировать эффект медикаментозного лечения.

1. Для количественного определения вируса засейте клетки Vero с плотностью 5 x 10⁵ клеток на лунку, если использовать 6-луночный планшет, как это было сделано в этом эксперименте. Сделайте это за сутки до заражения. Инкубируйте пластинчатые клетки в течение ночи, чтобы убедиться, что они сливаются для количественного определения вируса.
2. Аквотируйте 500 мкл бессывороточной среды в несколько микроцентрифужных пробирок. Вставьте стерильный тампон с ватным наконечником, смоченный в пробирки, не содержащие сыворотки. Ватные палочки необходимо окунуть и смочить не менее чем за 5 минут до использования.
3. Не повреждая нижележащую среду, транспортируйте инфицированную пластину роговицы свиньи в шкаф биобезопасности. С помощью влажных ватных палочек сделайте 3 оборота по часовой стрелке и 3 оборота против часовой стрелки на диаметре 5 мм от центра зараженной роговицы свиньи, не прикладывая чрезмерного давления.
4. Вставьте ватный тампон обратно в пробирку микроцентрифуги, заполненную сывороткой, и поверните ее по часовой стрелке и против часовой стрелки 5 раз. Металлический кончик ватного тампона должен быть коротко обрезан так, чтобы он целиком поместился в микроцентрифужную пробирку, а крышка может быть закрыта.
5. Поместите микроцентрифужную пробирку, содержащую ватный наконечник, на вихревую машину и работайте на высокой скорости в течение 1 минуты.
6. Выполните количественное определение вирусов с помощью анализа бляшек на этих образцах.
   заметка: Этот этап количественной оценки необходимо проводить на 2, 4 день и, по желанию, через 6 дней после заражения.

2. Количественное определение вируса с помощью анализа бляшек

ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы провести анализ бляшек, вырастите и запечатайте клетки Vero в 6-луночный планшет и обеспечьте 90% слияние клеток перед началом анализа. Используйте слияние 75 см² колбы этих ячеек. Все приведенные ниже шаги необходимо выполнять внутри шкафа биобезопасности.

1. Смойте сливающийся монослой клеток Vero в колбе 10 мл свежего фосфатного буферного раствора (PBS) после аспирации питательной среды. Повторите этап промывки еще раз с PBS после откачки первого набора моющих растворов.
2. Добавьте 1 мл 0,05% трипсина в монослой клетки. Выдерживать колбу при температуре 37 °C в течение 5 минут. Невооруженным глазом убедитесь, что ячейки отделены от внутренней поверхности колбы. Если нет, подождите еще 5 минут, прежде чем снова осмотреть колбу. Когда клетки кажутся отслоенными, добавьте 9 мл цельной среды в монослой, чтобы убедиться, что клетки полностью оторвались от поверхности колбы.
3. Соберите все клетки из колбы вместе со всей средой и поместите их в центрифужную пробирку объемом 15 мл.
4. Для каждой лунки из 6 луночных планшетов, которые используются для анализа бляшек, используйте 300 мкл из центрифужной пробирки. Долейте до каждой лунки 6-луночного планшета 2 мл цельной среды. Оставьте пластины в инкубаторе на ночь, чтобы они могли разрастись и образовать сливающийся монослой в каждой лунке.
5. Для того чтобы провести анализ бляшек, выполнить серийное разведение образцов нужно до количественного определения вируса.
6. Проведите логарифмическое 101-кратное разведение вируса в микроцентрифужных пробирках с использованием бессывороточных сред до тех пор, пока не будет достигнуто разведение в ^10-8 раз. Когда при ^10-3 разведении перенести 1 мл разведенного вещества на монослой покрытых клеток после аспирации питательной среды на клетках из 6-луночного планшета, это будет стадия инфекции. Инкубируйте зараженный планшет при температуре 37 °C в течение 2 ч.
7. Отсадите существующую инфекционную среду, дважды аккуратно промойте PBS для покрытия клеток и добавьте 2 мл среды, насыщенной метилцеллюлозой, на лунку во все 6 лунок. Инкубировать в течение 72 ч или до тех пор, пока не станет заметно образование бляшек. Бляшки можно идентифицировать по образованию небольших промежутков между клетками в клеточном монослое.
8. Медленно добавляйте 1 мл метанола в угол каждой лунки, используя стену в качестве направляющего наконечника. Инкубируйте 6-луночный планшет при комнатной температуре в течение 15 минут. Медленно отсасывайте содержимое каждой лунки из пластины, не нарушая и не взбалтывая монослой клеток.
9. Добавьте 1 мл кристаллического фиолетового рабочего раствора в каждую лунку 6-луночного планшета, убедившись, что все клетки покрыты. Инкубируйте 6-луночный планшет в темноте в течение 30 минут. Выбросьте кристаллический фиолетовый раствор, отасунув его, и просушите лунки на листе абсорбирующей бумаги.
10. Подсчитайте количество бляшек в самой высокой лунке разведения, чтобы количественно оценить общее содержание вируса в исходном растворе. Повторите процесс дважды, чтобы подтвердить титр вируса.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
30 г игл для подкожных инъекций.	БД	305128
Стеклянная бутылка объемом 500 мл.	Томас Сайенти	844027
Шкаф биобезопасности с сертификацией Bio-Safety Level-2 (BSL-2).	Thermofisher Scientific	Герасейф 2030i
Calgiswab 6" стерильный альгинат кальция стандартные тампоны.	пуританин	22029501
Скребок для ячеек - 25 см	Биологикс БЭ	70-1180 70-1250
Центрифужная трубка
Кристально-фиолетовый	Сигма Олдрич	С6158	Храните порошок в защищенном от света месте
Модифицированная среда Дульбекко Eagle's - DMEM	GIBCO	41966029	Хранить при температуре 4 °C до использования
этанол	Сигма Олдрич	Е7023
Фетальная бычья сыворотка -FBS	Сигма Олдрич	Ф2442	Аликвоту в пробирки объемом 50 мл и хранить в замороженном виде до использования
Элементы Vero	Коллекция американской типовой культуры ATCC	КРЛ-1586
Вихревая машина
метанол
Метилцеллюлоза
Микроцентрифужная пробирка
Свиная роговица	Park Packaging Co., Чикаго, Иллинойс		Специальный заказ по запросу
Процедура изготовления чехлов на столе - по мере необходимости.	Thermofisher Scientific	С42400
Серологические пипетки	Томас Сайенти	П7132, С7127, С7128, С7129, С7137
Оборудование для серологического пипетирования.	Томас Сайенти	Ezpette Pro
стереоскоп	Карл Цейсс	SteREO Discovery V20
Колбы для культуры тканей, T175 см2.	Томас Сайенти	Т1275
Инкубаторы для культивирования тканей, которые могут поддерживать температуру 5% CO2 и 37 °C	Thermofisher Scientific	Форма 50145523
Культивирование тканей обрабатывают планшетами (6-луночные).	Томас Сайенти	Т1006
трипсин