1. Деформации HSV и их обработка
ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа используются рекомбинантные нераспространяющиеся HSV-1(KOS) gL86 и HSV-2 (KOS) 333gJ- с репортерной активностью бета-галактозидазы.
- Используйте вирус из одной партии и храните при температуре -80 °C в соотношении 1:1 модифицированную среду Dulbecco Eagle's Medium (DMEM) с 20% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и обезжиренным молоком до использования. Перед хранением вирусной партии определяют концентрацию вируса с помощью анализа о-нитрофенил-β-D-галактопиранозида (ONPG) и 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-галактопиранозида (X-Gal).
- Определение жизнеспособности вируса и множественности инфекций (MOI) с помощью окрашивания X-Gal для каждого экспериментального анализа с использованием репортерного анализа на проникновение вируса, как описано ранее (рис. 1).
- Разбавьте вирус (Opt-MEM) до желаемого MOI. Зафиксируйте монослои (параформальдегид; 0,5 мл/лунка) перед окрашиванием. Поместите средства контроля жизнеспособности вируса в отдельную микротитровую пластину параллельно с полимикробными аналитическими планшетами.
2. Работа с ячейками HeLa 299
- Выращивание при 37 °C, 5%CO2 в DMEM с 4,5 г/л глюкозы, 10% инактивированной при нагревании фетальной бычьей сыворотки (FBS), гентамицином (50 мкг/мл) и L-глутамином. Пассаж клеток при 80% слиянии с раствором трипсина (этилендиаминтетрауксусная кислота, 0,53 М ЭДТА; 0,05% трипсин; 5 мл/колба).
3. Обращение с C. albicans
ПРИМЕЧАНИЕ: C. albicans, полученный из клинической лаборатории, хранится при -80 °C в среде обезжиренного молока Remmel 2x.
- Закваску замораживают на Sabouraud Dextrose Medium (37 °C). После 24-часовой субкультуры C. albicans помещается в среду Fungisel (37 °C; 48 часов) для использования.
- Создание форм зародышевой трубки (ГТ) (выберите репрезентативные колонии; 3 мл FBS; 3 ч; 37 °C; абсорбция600 (Abs600), 0,3). После инкубации промойте GT (Hanks' Balanced Salt Solution, HBSS; 2x; 4,000 x g). Добавьте промытый GT в подогретый HBSS (37 °C; 0,32 Abs600). Формы ГТ должны составлять 99% наблюдаемых клеток, что определяется по количеству гемоцитометров.
- Приготовьте дрожжевую форму (YF) для подвойных суспензий, выбрав репрезентативные колонии Fungisel (HBSS, 3 мл; 0,32 Abs600). Подсчитайте количество форм ЖЛ/мл микроскопически с помощью гемоцитометра. Формы ЖЛ должны составлять 99% наблюдаемых клеток по данным гемоцитометра.
- Сделайте рабочий грибной подвой (250 мкл ГТ или ЖФ в 25 мл HBSS; 37 °C; 105 колониеобразующих единиц, (КОЕ/мл)
4. Обращение с S. aureus
- Храните американскую коллекцию типовых культур S. aureus, ATCC 25923 (-80 °C; Remmel обезжиренное молоко 2x). Посев на агар из овечьей крови (5%; 37 °C; 24 ч). Соберите репрезентативные колонии и в течение 2 суток переведите в среду солей маннитола на запас (37 °С; 18 ч).
- Изготовьте стоковую суспензию S. aureus (3 мл HBSS; 1,32 Abs600;108 КОЕ/мл)
- Сделайте рабочий бульон S. aureus (100 мкл бульона в 25 мл HBSS; 105 КОЕ/мл).
5. Суспензии Candida и S. aureus
- Приготовьте смешанную суспензию C. albicans и S. aureus (250 мкл YF или GT и 100 мкл S. aureus в 25 мл HBSS).
6. Анализ полимикробной биопленки
- Засейте 96 луночных планшетов 200 μл 2 x 105 клеток HeLa/мл (уровень слияния 85%). Скальные плиты (30 - 45 мин; 37 °C) до инкубации (37 °C; 5%CO2 в инкубаторе; 18 ч). Стирка монослоев (1х; Opt-MEM), затем засейте с HSV (HSV-1 (KOS) gL86 или HSV-2 (KOS) 33 gJ- в 100 μл Opt-MEM ; MOI 50 и 10). Инкубируйте планшеты (3 часа; 37 °C; 5% CO2). Используйте только один вирусный штамм в день.
- Промойте зараженные монослои (1x; фосфатно-солевой буфер (PBS) с Mg+2 и Ca+2; 100 μл). Замените PBS на теплый HBSS, оставив по 25 мкл в каждой лунке.
- Добавьте рабочие суспензии YF, GT и/или S. aureus (100 мкл; целевое отношение к клеткам = 5:1; n = 16), как указано в таблице 1. Инкубируйте планшеты (статические; 30 мин; 37 °C; 5%CO2).
- После инкубации отсаживайте по одной колонке за раз, немедленно заполняя ее 300 мкл PBS с Mg+2 и Ca+2. Повторите этот шаг дважды, затем добавьте буфер для лизиса радиоиммунопреципитации (RIPA; фильтр стерилизованный; 200 мкл разведения 1:50).
- Быстро растирайте лизат клеток HeLa, затем поместите 50 мкл на соли маннитола (MS) и/или среду Fungisel (F) (Рисунок 2). Распределите лизат с помощью стеклянного стержня, согнутого под углом 90°. Инкубируйте планшеты (18 часов при 37 °C). Вручную подсчитайте количество колоний на тарелке. Контрольная группа состоит из S. aureus и/или C. albicans, прилипших к неинфицированным ВПГ клеткам HeLa.
Таблица 1. Определение общей матрицы адгезии микроорганизмов при полимикробных взаимодействиях.GT= фенотип зародышевой трубки Candida albicans; YF= Фенотип формы дрожжей C. albicans; MSSA = метициллин-чувствительный золотистый стафилококк; MS = среда солей маннита; F= Среда для содержания грибов.
