$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Решения и медиа
- Приготовьте 2X Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 среду, фосфатно-солевой буфер (PBS), бульон декстрозы Сабуро и агар декстрозы Сабуро, как показано в таблице 1.
2. Условия роста грибкового инокулята
- Храните все штаммы грибов в замороженном виде в 35% глицерине при температуре -80 °C до тех пор, пока они не понадобятся.
- Перед каждым экспериментом выполняйте следующие действия.
- Для штаммов Candida albicans:
- Разморозьте бутылочку и перелейте от 200 до 10 мл бульона декстрозы Сабуро в стерильную полипропиленовую пробирку объемом 50 мл с крышкой и заквашивайте на ночь при температуре 30 °C с перемешиванием (200 об/мин). Не забудьте наклонить трубку и оставить крышку слегка открытой для лучшей аэрации культуры.
- Для штаммов Cryptococcus neoformans:
- Соскребите замерзшую поверхность флакона с бульоном. Поместите клетки на агаровые планшеты с декстрозой Сабуро и инкубируйте в течение 48 ч при 30 °C. После видимого роста изолированных колоний держите пластины в холодильнике (4 °C) закрытыми парафиновой пленкой до 15 дней.
- Соберите изолированную колонию среднего размера из планшета с помощью стерильной зубочистки или стерильной инокуляционной петли и введите 10 мл бульона декстрозы Сабуро в стерильную коническую пробирку объемом 50 мл. Инкубировать в течение примерно 24 ч при 30 °C при перемешивании (200 об/мин).
- Не превышайте 24-часовую инкубацию. Не забудьте наклонить трубку и оставить крышку слегка открытой для лучшей аэрации. Всегда полезно стандартизировать стадию роста клеток перед каждым тестом, поскольку это важный фактор, влияющий на устойчивость к противомикробным препаратам><.
заметка: Оба гриба были выращены при температуре 30 °C для быстрого размножения в наших экспериментах, но температура может быть изменена в соответствии с целями исследования, например, клиническим лечением (37 °C). Самое главное, что это начальное время инкубации должно быть установлено заранее для каждого грибкового изолята и поддерживаться на протяжении всех тестов для обеспечения воспроизводимости.
- После роста грибков соберите клетки, центрифугируя конические пробирки при давлении 1200 x g в течение 5 минут при комнатной температуре. Выбросьте надосадочную жидкость и добавьте 10 мл PBS.
- Повторно суспендируйте клетки и снова центрифугируйте при 1200 x g в течение 5 минут при комнатной температуре.
- Повторите промывку PBS и центрифугирование еще дважды. После третьей промывки ресуспендировать клетки в 5 мл (в зависимости от размера гранул) среды 2X RPMI-1640.
- Приготовьте 1 мл разведения в соотношении 1:100 или 1:1000 в микроцентрифужной пробирке (в зависимости от мутности клеточной суспензии).
- Возьмите 10 мкл этого раствора, поместите его в камеру гемоцитометра и подсчитайте общее количество клеток в четырех угловых квадрантах под микроскопом. Рассчитайте концентрацию по формуле: (общее число ячеек/4) х коэффициент разбавления х 104 (константа разбавления в камере).
- Рассмотрите 100% жизнеспособность, если количество жизнеспособности и условия роста систематически коррелируют для изучаемого изолята><.
заметка: Стандартизация и контроль качества показателей жизнеспособности могут быть выполнены путем нанесения покрытия в соответствии с методом минимальной ингибиторной концентрации (MIC) Европейского комитета по тестированию чувствительности к противомикробным препаратам (EUCAST) для дрожжей.
- Если корреляция роста/жизнеспособности для исследуемого изолята не установлена, измерьте жизнеспособность гриба, подсчитав живые клетки в гемоцитометре с помощью красителей, которые избирательно окрашивают мертвые клетки, таких как флоксин B11, трипановый синий или янус зеленый. Используйте грибковые клетки для этого протокола только в том случае, если жизнеспособность популяции на этом этапе составляет 90% или выше><.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мертвые/живые красители могут не очень хорошо работать с выбранным грибком. Пожалуйста, проверьте их перед использованием. Например, трипановый синий краситель плохо работает с C. neoformans.
- После этого приготовьте клеточные суспензии в среде 2X RPMI-1640 (2X скорректированный посевной материал в среде RPMI-1640). Для 96-луночных планшетов учитывайте объем 5 мл для каждого планшета.
- Для всех штаммов C. albicans приготовьте суспензию стандартных клеток в концентрации 4 x 103 клеток/мл. Эта концентрация в 2 раза превышает конечную концентрацию клеток в каждой лунке (2 x 103 клеток/мл).
- Для штаммов C. neoformans готовят исходную культуру клеток 2 x 10 4 клеток/мл. Эта концентрация в два раза превышает конечную концентрацию клеток в каждой лунке (1 x 104 клеток/мл).
- Для других грибов проводите тест с известным противогрибковым препаратом, концентрация которого будет идеальной для конкретного исследования в зависимости от времени инкубации. Учитывайте метаболизм и время размножения гриба.
3. Пептиды (неизвестный агент)
- Храните лиофилизированные пептиды при температуре -20 °C и растворяйте их в деионизированной воде перед каждым экспериментом. Максимальное время хранения после растворения в воде будет зависеть от природы каждого пептида.
- Приготовьте аликвоты с максимальной конечной концентрацией, в два раза превышающей конечную концентрацию, проверенную в анализе (2X). В идеале приготовьте небольшое количество аликвот с достаточным количеством пептида для одноразового использования, чтобы избежать циклов замораживания-размораживания.
заметка: Выбор концентрации должен основываться на литературе и свойствах пептида. Рекомендуется начинать серийные разведения с приблизительно 100 мкМ пептида, а затем уменьшать или увеличивать этот диапазон концентраций в зависимости от полученных результатов.
4. Референсные противогрибковые препараты (положительный контроль)
- Для растворов, разведенных в воде: приготовьте раствор 2X с самой высокой концентрацией анализа (см. Раздел 5: Противогрибковый анализ для этапов разведения).
- Для штаммов C. albicans готовят раствор из 128 мкг/мл флуконазола или 128 мкг/мл каспофунгина. Концентрация в планшетах для обоих будет составлять 64 мкг/мл.
- Для штаммов C. neoformans приготовьте раствор из 32 мкг/мл амфотерицина B (водорастворимый раствор). Концентрация в планшетах составит 16 мкг/мл.
Примечание: Обычно амфотерицин В разводят в диметилсульфоксиде (ДМСО), так как это противогрибковое средство плохо растворяется в воде. Тем не менее, существуют водорастворимые препараты амфотерицина В, коммерчески доступные.
- Для противогрибковых средств, разведенных в органическом растворителе: приготовьте 100-кратный стоковый раствор в ДМСО, затем разбавьте его до 10-кратного количества в воде для использования.
заметка: Таким образом, в скважине конечная концентрация ДМСО не превысит 1%. Лунка, в которой грибок будет расти в среде, содержащей 1% ДМСО, в качестве контроля требуется, учитывая, что некоторые грибы плохо переносят такую концентрацию растворителя. Помните, что ДМСО является светочувствительным, поэтому накройте пластину фольгой или поместите ее в темную камеру на время инкубационного периода.
5. Противогрибковый анализ
ПРИМЕЧАНИЕ: Противогрибковые анализы in vitro проводятся на основе теста на чувствительность к микроразведению бульона из рекомендаций M27-A3 Института клинических и лабораторных стандартов (CLSI) с некоторыми изменениями.
- Готовят двукратное серийное разведение каждого пептида и контролируют противогрибковые препараты в 96-луночных полистирольных микропланшетах до конечного объема 50 мкл.
- С помощью пипетки добавьте 100 мкл противогрибкового препарата/пептида в концентрации в 2X от максимальной желаемой конечной концентрации в столбцах 1-3, в строке А.
- С помощью многоканальной пипетки добавьте 50 мкл стерильной воды в другие лунки рядами от B до H.
- Удалите 50 мкл лунок с самой высокой концентрацией (ряд А), переведите в следующую лунку следующей концентрации (ряд В) и гомогенизируйте.
- Повторяйте вышеуказанные действия до лунки с наименьшей концентрацией и выбросьте 50 мкл этой лунки (строка H). Оставьте в столбцах 11 и 12 (строки A, B, C) только воду для контроля пустоты или для контроля отрицательного/роста.
- Добавьте 50 мкл 2-кратно скорректированного инокулята в среде RPMI-1640 в каждую лунку (столбцы 1-3 плюс столбец 11 (отрицательный/контроль роста)); конечная концентрация для C. albicans составит 2 x 103 клеток/мл, а конечная концентрация для штаммов C. neoformans составит 104 клеток/мл.
- Подготовьте заготовки для контроля (50 мкл воды + 50 мкл среды 2X RPMI-1640 без клеток) и отрицательных/растительных регуляторов (50 мкл воды + 50 мкл скорректированного инокулята 2X RPMI-1640 среды без противогрибкового средства) и загрузите их в луночный планшет, как описано выше.
- Повторите процедуру для каждого тестируемого соединения и выбранного противогрибкового средства борьбы (колонки 4-10).
заметка: Серийные разведения могут быть выполнены вертикально, как в эксперименте ниже, или горизонтально в планшете (т.е., если количество разведений данного соединения/экстракта, которое необходимо проверить, составляет восемь или более).
- Если соединения, референтные препараты или любой из его компонентов являются фоточувствительными, проводите анализ при сниженном освещении, накрывайте планшеты фольгой или помещайте в темную камеру во время инкубации.
- Примите во внимание следующие необязательные рекомендации.
- Закройте пластину прозрачной крышкой, обеспечивающей газообмен, так как это помогает уменьшить испарение.
- Поместите пластину во влажную камеру, это также поможет уменьшить испарение.
- Планшеты инкубируют при 37 °C в течение 24 ч или 48 ч для всех штаммов C. albicans и в течение 48 ч при встряхивании со скоростью 200 об/мин для C. neoformans. Нижний конечный объем (100 μл) предотвращает утечку.
заметка: Существенной разницы между показаниями MIC через 24 ч и 48 ч для штаммов C. albicans не наблюдалось. Тем не менее, показания в 48 часов легче визуализировать.
- Наблюдайте за всеми лунками с помощью инвертированного оптического микроскопа до инкубационного периода и после него, чтобы проверить изменения в морфологии, а также проверить признаки загрязнения.
заметка: Показания могут быть сделаны визуально и сфотографированы в конце эксперимента. Перед каждым снятием слегка гомогенизируйте пластину. Чтение также может быть выполнено путем измерения его наружного диаметра на длине волны 600 нм, если не наблюдаются скопления клеток или филаментация.
- Проводите эксперименты не менее трех раз в разные даты.
Таблица 1. Подготовка сред и реагентов.
| Терпимая | подготовка |
| 2X Мемориальный институт Розуэлл Парк (RPMI) 1640 средний – 500 мл | 10,4 г RPMI-1640 (с добавлением L-глютамина и фенола красного; без бикарбоната) |
| 330 мМ 3-(N-морфолино) пропансульфоновая кислота (MOPS) |
| Настройка pH до 7,0 с помощью NaOH |
| Стерилизация фильтрацией (фильтр 0,22 μM) |
| Фосфатный буферный раствор (PBS) | 137 мМ NaCl |
| 2,7 мМ KCl |
| 10 мМ Na2HPO4 |
| 2 мМ КН2ГО4 |
| Автоклав при 121°C в течение 15 минут. |
| Отвар декстрозы Sabouraud | 15 г порошка на 500 мл дистиллированной воды. |
| Настройка pH до 7,0 с помощью NaOH |
| Автоклав при 121°C в течение 15 минут. |
| Сабуро Декстроза Агар | 32,5 г порошка в 500 мл дистиллированной воды. |
| Настройка pH до 7,0 с помощью NaOH |
| Автоклав при 121°C в течение 15 минут. |