Анализ использования АТФ для определения выживаемости бактерий при лечении антибиотиками

Аннотация

Источник: Ван, Лян-Чунь и др. Количественное исследование чувствительности агрегатов Neisseria gonorrhoeae к антибиотикам с использованием коммерческих анализов АТФ и окрашивания живых/мертвых. J. Vis. Exp. (2019).

В этом видео описывается простой анализ измерения АТФ с использованием реагента люциферазного свечения. Этот анализ используется для количественной оценки выживаемости Neisseria gonorrhoeae после лечения цефтриаксоном.

Протокол

1. Количественная оценка жизнеспособности агрегатов GC

1. Соберите ГК с помощью стерильного аппликатора. Смыть ГХ с планшета и повторно суспендировать ГХ в предварительно подогретом бульоне (ГХП, табл. 1) с добавлением 4,2% растворов NaHCO₃ и 1% Kellogg. Используйте спектрофотометрию на длине волны 650 нм (наружный диаметр 650 1 = ~1 x 10⁹ КОЕ/мл) для определения концентрации взвешенных бактерий.
2. Отрегулируйте концентрацию ГХ до ~1 x 10⁸ КОЕ/мл.
3. Добавьте 99 мкл отрегулированной суспензии GC в лунки 96-луночного планшета.
4. Инкубируйте планшет в течение 6 часов при 37 °C с 5%_CO2, чтобы бактерии могли накапливаться.
5. Добавьте по 1 мкл серийно разведенного цефтриаксона (1000, 100, 50, 25, 12,5, 6,2, 3,1, 1,5, 0,8, 0,4, 0,2 мкг/мл) в каждую лунку. Оставьте некоторые лунки необработанными, чтобы они служили контрольными.
6. Инкубируйте планшет в течение 24 часов при температуре 37 °C с 5%_CO2.
7. Ультразвуковой обработкой суспензии 3 раза в каждую лунку в течение 5 с при 144 Вт и частоте 20 кГц.
8. Добавьте 100 мкл коммерчески доступного реагента для использования АТФ в каждую лунку, пипетируйте вверх и вниз 3 раза и инкубируйте в течение 15 минут при 37 °C с 5%_CO2.
9. Осторожно перелейте 150 мкл смеси из каждой лунки в новую лунку в 96-луночном черном микропланшете и избегайте образования пузырьков.
10. Измерьте поглощение каждой лунки на длине волны 560 нм с помощью планшетного ридера.
11. Рассчитывают выживаемость по отношению показаний, полученных после серийного лечения цефтриаксоном, к показаниям из необработанных скважин.

2. Флуоресцентный микроскопический анализ живых/мертвых агрегатов GC

1. Соберите ГК с помощью стерильного аппликатора. Смойте ГХ с планшета и повторно суспендируйте ГХ в предварительно подогретой среде ГХП плюс 1% добавки Kellogg.
2. Определите количество бактерий методом спектрофотометрии на длине волны 650 нм и отрегулируйте концентрацию GC до ~1 x 10⁷ КОЕ/мл.
3. Добавьте 198 мкл суспензии GC в 8-луночные камеры с покровным дном.
4. Инкубируйте камеру в течение 6 часов при 37 °C с 5%_CO2 для образования агрегатов.
5. Добавьте 2 мкл цефтриаксона (100 мкг/мл или различные разведения) в каждую лунку в каждом состоянии агрегации. Инкубируйте в течение желаемого времени при 37 °C с 5%_CO2.
6. Добавьте 0,6 мкл смеси живого/мертвого окрашивающего раствора в каждую лунку и инкубируйте в течение 20 минут при 37 °C с 5%_CO2.
7. Получение изображений серии Z с помощью конфокального микроскопа (можно использовать эквивалентный микроскоп).
8. Анализируйте изображения с помощью программного обеспечения ImageJ для измерения размера GC-агрегатов и отношения интенсивности флуоресценции FIR окрашивания живых и мертвых в каждом агрегате.

Таблица 1: Рецепт 1 л бактериальной среды для роста GCP.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
100x Добавка Kellogg's
агар	Биологическая служба США	А0930
Анализ BacTiter	Компания Promega	Г8232
Цефтриаксон	ОТК	С2226
Difco GC средняя база	БД	No 228950 (Английский
Нитрат железа, нонагидрат	Сигма-Олдрич	254223-10Г
глюкоза	Thermo Fisher Scientific	БП350-1
BacLight окрашивание живыми/мертвыми	Инвитроген	Л7012
MS11 Neisseria gonorrhoeae штамм			любезно предоставлено доктором Германом Шнайдером, Армейский научно-исследовательский институт Уолтера Рида
Ультразвуковой аппарат	Контес		Эквивалент 9110001

)