Определение роли нейтрофилоподобных клеток в чувствительности клеток лимфомы к тестируемому препарату

Аннотация

Источник: Hirz, T., et al. Выделение и анализ нейтрофилов для определения их роли в чувствительности клеток лимфомы к терапевтическим агентам. J. Vis. Exp. (2016).

Это видео демонстрирует анализ, исследующий роль нейтрофильных клеток в защите клеток лимфомы от цитотоксичности химиотерапевтических агентов. Трехмерная кокультура, состоящая из лимфомы и нейтрофильных клеток, устанавливается и подвергается воздействию винкристина — химиотерапевтического препарата. Прямой контакт с нейтрофилоподобными клетками вызывает повышенную регуляцию антиапоптотических белков в клетках лимфомы, тем самым способствуя их выживанию в присутствии винкристина.

Протокол

1. Дифференцировка клеток HL60 по гранулоцитарному пути и их кокультура с В-клетками лимфомы RL в 3D-модели

1. Дифференцировка промиелоцитарных (HL60) клеток человека в нейтрофилоподобные клетки
   1. Отрегулируйте количество клеток HL60 до 3 x 10⁵ клеток/мл, затем добавьте 1 мкМ ретиноевую кислоту (RA) и 1,25% ДМСО, чтобы вызвать их дифференцировку. Засейте по 3 x 10 5 клеток HL60 в лунку в 48-луночный планшет, затем инкубируйте в течение 48 часов при 37 °C с 5%_CO2.
   2. Затем соберите клетки и центрифугируйте при 300 г в течение 5 мин при RT. Повторно суспендируйте клетки полной средой RPMI для подсчета с помощью счетчика жизнеспособности клеток.
   3. Затем разбавляют клеточную суспензию в полной среде RPMI, чтобы довести количество клеток HL60 до 3 x 10⁵ клеток/мл и снова индуцировать их дифференцировку путем добавления 1 мкМ ретиноевой кислоты (RA) и 1,25 % диметилсульфоксида (ДМСО). Засейте по 3 x 10 5 клеток HL60 в лунку в 48-луночный планшет и инкубируйте еще 48 часов при 37 °C с 5%_CO2.
2. Анализ дифференциации HL60 (HL60diff)
   1. Соберите клетки и центрифугируйте пробирки при давлении 300 г в течение 5 мин в режиме RT. Повторно суспендируйте гранулу полной средой Roswell Park Memorial Institute (RPMI) для подсчета с помощью счетчика жизнеспособности клеток.
   2. Проанализировать изменения экспрессии маркеров клеточной поверхности с помощью проточной цитометрии. Поместите каждые 3 x 10⁵ недифференцированных клеток HL60 (из клеточной культуры) и 3 x 10⁵ дифференцированных клеток HL60 в пластиковые пробирки объемом 5 мл для анализа флуоресцентно-активируемой сортировки клеток (FACS) и центрифугируйте пробирки при 300 г в течение 5 минут при RT.
   3. Ресуспендируйте гранулы в 50 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS)-фетальной бычьей сыворотки (FBS) (4%). Пометьте клетки античеловеческим CD11b, конъюгированным с AF700, или античеловеческим CD38, конъюгированным с APC (5 мкл/10⁶ клеток). Инкубируйте клетки в темноте в течение 30 минут при температуре 4 ^°С.
   4. Промыть 500 мкл PBS-FBS (4%) затем центрифугировать при 300 г в течение 5 мин при RT. Повторно суспендировать гранулы в 200 мкл PBS-FBS (4%).
   5. Анализ на проточном цитометре с использованием стратегии стробирования на рисунке 1A и следующей оптической конфигурации: лазер 488 нм: FSC-A (488 нм), SSC-A (488/10 BP); лазер 633 нм: APC (660/20 BP), Alexa Fluor 700 (730/45 BP).
   6. Чтобы проверить морфологические измененияв HL60 diff, иммобилизуйте клетки на стеклянных предметных стеклах для микроскопического исследования.
      1. Для этого ресуспендируют каждые 3 x 10⁴ недифференцированные клетки HL60 (из клеточной культуры) и 3 x 10⁴ HL60 diff в полной среде RPMI объемом 150 мкл. Соберите стеклянные предметные стекла, фильтрующие карты и камеры для образцов в центрифуге с цитоспином, обеспечив балансировку центрифуги.
      2. Поместите каждый тип клеток в камеру для образцов и цитоцентрифугу при 1 500 об/мин на 10 минут при RT. Извлеките предметные стекла, фильтрующие карты и камеры для образцов из центрифуги. Разбирайте аккуратно, чтобы не повредить элементы на предметном стекле. Выбросьте фильтрующие карты и камеры для образцов.
      3. Окрашивайте ячейки с помощью набора для окрашивания Giemsa и держите предметные стекла в течение 1 часа для высыхания. Исследуйте клетки под микроскопом со 100-кратным увеличением.
3. 3-мерная (3D) культура<бр /> заметка: Убедитесь, что материалы, используемые в этом эксперименте, холодные, а эксперимент проводится на льду.
   1. Ресуспендируйте каждые 5 x 10⁴ RL клетки, отдельно или смешанные с HL60diff в соотношении RL:HL60diff 1:10, с матрицей базальной мембраны объемом 300 мкл с помощью наконечника пипетки объемом 1 мл, разрезанного стерильными ножницами, чтобы расширить отверстие примерно до 2-3 мм. Избегайте образования пузырей на этом этапе.
   2. Засейте по 300 мкл клеточной суспензии/лунки в 24-луночный планшет. Избегайте образования пузырей на этом этапе. Инкубируйте планшет в течение 30 минут при 37 °C с 5%_CO2, затем добавьте 1 мл полной среды RPMI для каждой лунки и инкубируйте в течение 7 дней при 37 °C с 5%_CO2. Меняйте среду каждые два дня. Добавьте 10 нМ винкристин на 5 день.
4. Анализ FACS
   1. После 7 дней культивирования отсадите среду и промойте каждую лунку 1 мл ледяной PBS дважды. Добавьте 3 мл в лунку ледяной PBS-этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) (5 мМ). Отделите гель от дна лунки, соскоблив его с помощью дна наконечника пипетки объемом 200 мкл. Аккуратно встряхните тарелку на льду в течение 30 минут.
   2. Переложите клеточную суспензию в стерильную пробирку объемом 15 мл и осторожно встряхните пробирки на льду еще 30 мин. Проверьте наличие однородной клеточной суспензии. (Если это не так, то встряхните клетки в течение более длительного времени или добавьте больше PBS-EDTA).
   3. Центрифугируйте пробирки при 300 x g в течение 10 минут при RT. Промойте гранулы PBS, затем центрифугируйте при 300 x g в течение 10 минут при RT.
   4. Ресуспендировать PBS-FBS (4%) и пометить античеловеческим антителом CD19, конъюгированным с PE-Cy7, и античеловеческим антителом CD38, конъюгированным с APC (5 мкл/10⁶ клеток). Выдерживать в темноте в течение 30 минут при температуре 4 ^°C.
   5. Промыть 500 мкл PBS-FBS (4%), затем центрифужировать пробирки при 300 г в течение 5 мин при RT. Ресуспендировать элементы с помощью Аннексина V и PI с использованием коммерческого набора.
   6. Анализируйте на проточном цитометре с использованием стратегии стробирования на рисунке 2А и следующей оптической конфигурации: лазер 488 нм: FSC-A (488 нМ), SSC-A (488/10 BP), FITC (530/30 BP), PI (610/20 BP), PE-Cy7 (780/60 BP); лазер 633 нм: APC (660/20 BP). Обеспечьте цветовую компенсацию.

Результаты

Рисунок 1. Структурные параметры дифференцированных клеток HL60. (A) Графики прямого рассеяния (FSC) и бокового рассеяния (SSC) представляют клетки HL60 и дифференцированные клетки HL60 (HL60diff). (B) Дифференциальные клетки HL60 и HL60 мечили анти-CD11b-AF700 или анти-CD38-APC с последующим анализом проточной цитометрии. После стробирования каждой...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
РПМИ 1640	Gibco Invitrogen	No 21875-034
Фетальная бычья сыворотка (FBS)	Gibco Invitrogen	10270-106
Фосфатно-солевой буфер (PBS содержит кальций и магний)	Gibco Invitrogen	14040-091
Винкристин	EG лабо
Матрица базальной мембраны BD Matrigel	BD Biosciences	354234	Поставить при температуре 4 °C на ночь перед днем эксперимента
Диметилсульфоксид (ДМСО)	Сигма-Олдрич	Д8418
Ретиноевая кислота	Сигма-Олдрич	Р2625
Бычий сывороточный альбумин (BSA)	Сигма-Олдрич	А7906
Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА)	Сигма-Олдрич	Е5134
Прилагаемый набор для окрашивания V-FLOUS	Рош	11 988 549 001
Набор RAL 555 Модифицированный набор для окрашивания Giemsa	Космос Биомедикал	CB361550-0000
Проточная цитометрия LSRII	BD Biosciences
Цитоцентрифуга	Термо Сайентиал
Микроскоп Leica DMR-XA	Leica Microsystems
Cellometer Auto T4 Счетчик жизнеспособности клеток	Nexcelom Bioscience