Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Инокуляция мышей C57BL/6 опухолевыми клетками, экспрессирующими T Ag
- Выращивайте трансформированную SV40 клеточную линию фибросаркомы C57SV (или аналогичную адгезивную клеточную линию T Ag+) в модифицированной среде Dulbecco Eagle's Medium (DMEM) с 4,5 г/л D-глюкозы и L-глутамина (1x) и с добавлением 1 мМ пирувата натрия и 10% термоинактивированной фетальной бычьей сыворотки (FBS) в обработанных культурами тканевых колбах при температуре 37 °C в увлажненной атмосфере, содержащей 10% углекислого газа (CO2).
- Как только клетки полностью сливаются или слегка сливаются, аккуратно удалите и выбросьте среду и промойте монослой предварительно подогретым стерильным фосфатно-солевым буфером (PBS).
ПРИМЕЧАНИЕ: Максимальная экспрессия T Ag достигается, когда клетки T Ag+ достигают 100% конфлюенции.
- Внутрь шкафа биологической безопасности добавьте предварительно подогретую трипсин-этилендиаминтетрауксусную кислоту (трипсин-ЭДТА) (0,25%), чтобы покрыть монослой при комнатной температуре, пока клетки не будут сбиты пятнами. Постучите по стенкам колбы (колб) для культур несколько раз, чтобы освободить оставшиеся адгезивные клетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости и для ускорения процесса трипсинизации перенесите колбу (колбы) в инкубатор с температурой 37 °C. Смещенные клетки быстро примут округлую форму под световым микроскопом. Этот шаг должен длиться примерно 5 минут.
- Добавьте 5 мл среды DMEM и диссоциируйте комки, чтобы получить одноклеточную суспензию, пипетируя содержимое каждой колбы вверх и вниз.
- Перенесите клеточную суспензию через клеточный фильтр с порами 70 мкм в пробирку.
- Вращайте пробирку при 400 x g в течение 5 минут при 4 °C.
- Выбросьте надосадочную жидкость. Ресуспендируйте гранулированные клетки в 10 мл стерильного, холодного PBS.
- Повторите шаги 1.6 и 1.7 дважды.
- Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра. Приготовьте однородную суспензию, содержащую 4 x 107 клеток/мл стерильных PBS.
- Введите 500 мкл вышеуказанной суспензии внутрибрюшинно (в/в) каждому взрослому (6-12-недельному) самцу или самке мыши C57BL/6.
2. Схемы лечения
- Схема лечения для изучения вклада клеток nTreg в иммунодоминирование TCD8
- За четыре дня до прайминга in vivo мышам C57BL/6 с клетками C57SV (шаг 1.10) введите каждому животному однократно в/к 0,5 мг низкоэндотоксинного, безазидного моноклонального антитела (mAb) к CD25 (клон PC-61.5.3), которое истощает клетки nTreg, или с контролем изотипа IgG1 у крысы (например, клон KLH/G1-2-2, клон HRPN или клон TNP6A7).
- Схема лечения для проверки in vivo значимости взаимодействий запрограммированных белков клеточной смерти (PD-1-PD-L1(2)) в формировании иммунодоминирования TCD8
Примечание: Вовлечение PD-1 в PD-L1 часто, но не всегда, опосредует совместное ингибирование и/или истощение Ag-специфичного TCD8. Таким образом, лечение анти-PD-1 может быть выполнено параллельно с введением анти-PD-L1 и анти-PD-L2 mAb для выявления точного межклеточного взаимодействия, участвующего в биологическом феномене.
3. Получение целевых спленоцитов
- Эвтаназируйте наивных мышей C57BL/6 соответствующего пола (в возрасте 6-12 недель), которые будут служить донорами спленоцитов при вывихе шейки матки.
- Поместите каждую мышь брюшком вверх внутрь шкафа биологической безопасности. Распылите на кожу 70% (v/v) этанола, EtOH. С помощью стерильных щипцов и ножниц подтяните кожу и сделайте небольшой вентральный разрез по средней линии. Затем разрежьте кожу крест-накрест, чтобы обнажить брюшину.
- С помощью щипцов подтяните брюшину шатерообразно, не задев ни одного из внутренних органов. Разрежьте брюшину, чтобы обнажить брюшинную полость, и аккуратно удалите селезенку.
- Поместите селезенку (селезенки) внутрь тканевого измельчителя Dounce объемом 15 мл, содержащего 5 мл стерильного PBS. Надавливайте вручную с помощью стеклянного поршня кофемолки до тех пор, пока ткань селезенки не рассеется в красную однородную клеточную суспензию.
Примечание: В зависимости от количества животных-реципиентов в экспериментальной группе, для препарирования клеток-мишеней может потребоваться несколько донорских селезенок мышей. В кофемолке объемом 15 мл можно гомогенизировать до 3 селезенок.
- Переложите гомогенат в пробирку объемом 15 мл. Вращайте пробирку при 400 x g в течение 5 минут при 4 °C.
- Выбросьте надосадочную жидкость. Ресуспендировать гранулированные клетки в 4 мл аммоний-хлоридно-калий-калийного (ACK) лизирующего буфера на 4 мин для элиминации эритроцитов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг зависит от времени. Чрезмерное воздействие на спленоциты лизирующего буфера ACK увеличит их хрупкость и сделает их восприимчивыми к неспецифической клеточной гибели.
- В каждую пробирку добавьте 8 мл среды Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640), содержащей 10% термоинактивированного FBS, L-аланил-L-глутамина, 0,1 мМ заменимых аминокислот минимально незаменимой среды (MEM), 1 мМ пирувата натрия, 10 мМ 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазитансульфоновой кислоты (HEPES) и 1x пенициллин/стрептомицин, которые далее будут называться полной средой RPMI (Таблица материалов).
- Перенесите содержимое через 70 мкм пор клеточного фильтра в новую пробирку объемом 15 мл.
- Вращайте пробирку при 400 x g в течение 5 минут при 4 °C.
- Выбросьте надосадочную жидкость. Ресуспендируйте гранулированные элементы в 12 мл полного RPMI.
- Разделите суспензию спленоцитов на 3 равные порции (по 4 мл каждая) в 3 отдельных пробирках.
4. Покрытие целевых спленоцитов нерелевантными и родственными пептидами
- Пометьте пробирки в соответствии с пептидами, которые будут использоваться для пульсации целевых спленоцитов. Контрольные спленоциты будут импульсировать нерелевантным пептидом, и каждая популяция родственных целевых спленоцитов будет импульсирована синтетическим пептидом, соответствующим иммунодоминантному эпитопу, производному от T Ag (сайт IV) или субдоминантному эпитопу T Ag (сайт I или сайт II/III) (Таблица 1).
Примечание: Выбор нерелевантных пептидов зависит от экспериментальной установки и штамма мыши, используемого в каждом исследовании. Авторы часто используют gB498-505 (H-2K b-ограниченный иммунодоминантный пептидный эпитоп вируса простого герпеса [HSV]-1) и/или GP33-41 (H-2Db-ограниченный иммунодоминантный пептидный эпитоп вируса лимфоцитарного хориоменингита ([LCMV]) у мышей C57BL/6 (табл. 1). Эти пептиды являются оптимальным выбором, потому что: (i) они получены из патогенов, ранее не встречавшихся в описанной здесь мышиной модели; (ii) подобно пептидам, полученным из T Ag, gB498-505 и GP33-41 ограничены молекулами H-2b и связываются с ними. В «трехпиковых» анализах на уничтожение in vivo каждый из двух пиков, соответствующих родственным клеткам-мишеням, может представлять собой спленоциты, пульсирующие иммунодоминантным или субдоминантным пептидом. Выбор каждого набора пептидов варьируется в зависимости от целей каждого эксперимента. Примеры таких вариаций см. на рисунках 1 и 2. Для остальной части этого протокола сайты I и IV, полученные из T-Ag, будут представлять собой субдоминантные и иммунодоминантные пептиды соответственно.
- Измельчите содержимое каждой меченой пробирки с 1 мкМ соответствующего пептида в течение 1 ч при 37 °C и 5%CO2.
- Используйте отдельное сетчатое фильтр для клеток (с порами 70 мкм) для каждой пробирки, чтобы при необходимости удалить комки и мусор.
- Вращайте пробирку при 400 x g в течение 5 минут при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость.
- Ресуспендируйте гранулированные клетки в 12 мл стерильного холодного PBS и повторите шаг 4.4 еще раз><.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно удалить как можно больше FBS, потому что FBS может связывать карбоксифлуоресцеин сукцинимидиловый эфир (CFSE) на следующем этапе.
5. Мечение целевых спленоцитов с помощью CFSE
- Ресуспендируйте импульсные спленоциты пептидами в 4 мл стерильного PBS.
- Добавьте CFSE в концентрациях 0,025 мкМ, 0,25 мкМ и 2 мкМ в пробирки, содержащие нерелевантные пептидные, I- и IV импульсные спленоциты соответственно.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения равномерной маркировки CFSE держите каждую пробирку под углом 45° перед добавлением CFSE на сторону, немного возвышающуюся над клеточной суспензией, после чего немедленно следует осторожное вортексирование. Это обеспечит появление плавных гистограмм в конце. Вариации интенсивности CFSE от партии к партии и в зависимости от возраста не являются редкостью. Таким образом, может потребоваться поэкспериментировать с дифференциальными дозами CFSE, прежде чем принять решение об оптимальных концентрациях, которые следует использовать.
осторожность: CFSE токсичен при концентрациях выше 5 мкМ.
- Поместите пробирки в инкубатор с температурой 37 °C на 15 минут и переворачивайте их каждые 5 минут.
- Добавьте 3 мл термоинактивированного FBS в каждую пробирку, чтобы остановить реакцию CFSE. Долейте содержимое стерильным PBS.
- Вращайте пробирку при 400 x g в течение 5 минут при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость.
- Ресуспендируйте гранулированные клетки в 12 мл стерильного PBS и повторите шаг 5.5.
6. Изучение адекватной/равной маркировки CFSE целевых популяций спленоцитов
- Ресуспендируйте гранулированные клетки в 3 мл PBS.
Осторожно проведите - по вихревым трубкам. Перенесите по 10 мкл низкой,промежуточной (int) и высококлеточной суспензии CFSE снизким содержанием CFSE в пробирку для сортировки клеток (FACS) из полистирола с круглым дном, содержащую 200 мкл PBS.
- Опрашивайте клетки с помощью проточного цитометра, оснащенного лазером с длиной волны 488 нм. Нарисуйте ворота лимфоцитов на основе свойств прямого рассеяния (FSC) и бокового рассеяния (SSC) клеток, прежде чем получить 5000 событий, попадающих в ворота лимфоцитов в канале FL-1.
- В «родительской» популяции CFSE+ нарисуйте дополнительные вентили гистограммы для определениясубпопуляций CFSE low, CFSEint иCFSE high.
- Подтвердите равное или почти равное количество событий в трех шлюзах. При необходимости отрегулируйте количество клеток в «исходных» пробирках (шаг 6.1) перед смешиванием и введением целевых спленоцитов наивным и подготовленным мышам в разделе 7.
7. Инъекция целевых клеток, меченных CFSE, наивным и T-Ag-праймированным реципиентам
Аккуратно закрутите - трубки источника. Перенесите три меченые CFSE клеточные суспензии в равных пропорциях в новую пробирку.
- Долейте содержимое стерильным PBS.
- Вращайте пробирку при 400 x g в течение 5 минут при 4 °C. Ресуспендируйте гранулированные клетки стерильным PBS.
- Подсчитайте клетки трипанового синего с помощью гемоцитометра, чтобы обеспечить жизнеспособность клеток не менее 95%.
- Отрегулируйте объем, чтобы ввести 1 x 107 смешанных клеток-мишеней/200 мкл PBS внутривенно (в/в) через хвостовую вену каждому реципиенту мыши C57BL/6.
ПРИМЕЧАНИЕ: Храните клетки на льду между инъекциями. Аккуратно перемешивайте клетки-мишени перед каждой инъекцией. Запишите точное время инъекции для каждой мыши, что определит, когда животное нужно будет усыпить. Важно поддерживать постоянную продолжительность цитотоксичности in vivo у всех животных в одном эксперименте.
8. Сбор данных
- Через два-четыре часа после инъекции меченых CFSE клеток-мишеней усыпить мышей-реципиентов путем вывиха шейки матки.
Продолжительность цитотоксичности in vivo может варьироваться в зависимости от используемой экспериментальной системы, иммуногенности целевых Ags, ожидаемого содержания пептид-антиген-специфических TCD8 в селезенке и устойчивости их литической функции, а также других факторов.
- Удалите и обработайте каждую селезенку отдельно, как в пунктах 3.2−3.9.
- Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулированные клетки в 3 мл PBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте особенно осторожны при работе с препаратами селезеночной ткани и клеток при температуре 4 °C или на льду перед цитофлуориметрическим анализом. Это необходимо для предотвращения продолжения цитотоксичности ex vivo.
- Перенесите примерно 1х107 клеток из каждой обработанной селезенки в чистую пробирку FACS.
- Опрашивайте клетки немедленно с помощью проточного цитометра, оснащенного лазером с длиной волны 488 нм. Нарисуйте ворота лимфоцитов на основе свойств FSC и SSC клеток.
- Идентификация спленоцитов CFSE-реципиента и переносимых клеток-мишеней CFSE+. Нарисуйте дополнительные вентили, вмещающие различные популяции целевых клеток CFSElow, CFSEint иCFSE high.
- Приобретите в общей сложности 2000низких событий CFSE в канале FL-1.
9. Анализ данных
- Рассчитайте специфический лизис каждой родственной популяции клеток-мишеней по следующей формуле:
% Удельная цитотоксичность = 
где x = CFSEint/high event number у T Ag-primed мыши, y =CFSE low event number у T Ag-primed mouse, a = CFSEint/high event number у наивной мыши и b =CFSE low event number у наивной мыши.
заметка: В анализах цитотоксичности «трех пиков», в которых оценивается специфический лизис более чем одной родственной целевой популяции, использование частот клеток-мишеней нецелесообразно. Это происходит просто потому, что на частоту популяции родственных клеток-мишеней влияет не только процент нерелевантных контрольных клеток, но и процент других родственных целевых спленоцитов. Таким образом, в приведенной выше формуле следует использовать номера событий внутри каждого затвора для точного расчета лизиса каждой родственной популяции клеток-мишеней (либо CFSEint, либоCFSE high cells) по сравнению снизким контролем CFSE.
Таблица 1. Пептиды, вводимые в этот протокол.
| Источник белкового антигена | Пептидный эпитоп | обозначение | последовательность | Ограничение MHC I |
| SV401 Большой T Ag2 | Т Аг206-215 | Сайт I | САИННЯККЛЬ | Н-2Db |
| SV40 Большой T Ag | Т Аг223-231 | Участок II/III | CKGVNKEYL | Н-2Db |
| SV40 Большой T Ag | Т Аг404-411 | Площадка IV | ВВЫДФЛКЦ | Н-2Кб |
| SV40 Большой T Ag | Т Аг489-497 | Зона V | QGINNLDNL | Н-2Db |
| ВПГ-13 Гликопротеин В | gB498-505* | ГБ:498-505 | ССИЕФАРЛ | Н-2Кб |
| LCMV4 Гликопротеин | ГП33-41* | ГП33-41 | КАВИНФАТЦ | Н-2Db |
| 1Обезьяний вирус 40 | | | | |
| 2Большой опухолевый антиген | | | | |
| 3Вирус простого герпеса типа 1 | | | |
| 4Вирус лимфоцитарного хориоменингита | | | |
| *используется как нерелевантный пептид | | | |
