Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.
Примечание: Используемая плазмида Lifeact-mCherry - это добрый подарок доктора Гийома Монтаньяка, Институт Кюри, Париж.
1. Клетки и трансфекция
Примечание: макрофаги RAW264.7 выращивают до субслияния в полной среде (RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 medium, 10 mM HEPES, 1 mM пируват натрия, 50 μM β-меркаптоэтанол, 2 mM L-глутамина и 10% FCS (Fetal Calf Serum)) в 100 мм планшете. Они трансфицируются плазмидами, кодирующими флуоресцентно помеченные белки, с помощью электропорации. Как правило, приблизительно 5 - 6 x 106 клеток трансфицируют 20 мкг или 10 мкг плазмиды для каждой трансфекции или ко-трансфекции соответственно. Отметим, что в качестве альтернативных подходов могут быть использованы и другие способы трансфекции, основанные на электропорации или липофекции.
- Соскребите клетки с помощью клеточного подъемника и повторно суспендируйте их в 10 мл питательной среды, пипетируя вверх и вниз несколько раз.
- Центрифугируйте ячейку суспензии 300 x g, 5 мин при RT в роторе с углом качания.
- Разогрейте 10 мл готовой среды с добавлением 10 мкг/мл гентамицина до 37 °С.
- После центрифугирования выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 3 мл «промывочного буфера А» из набора для электропорации.
- Центрифугируйте ячейку суспензией 300 x g, 5 мин при комнатной температуре в роторе с качающимся углом наклона.
- Тем временем приготовьте смесь ДНК при комнатной температуре: 120 мкл 2x буфера B, 20 мкг плазмидной ДНК, кодирующей интересующий белок, q.s.p. 240 мкл H2O.
- После центрифугирования выбросьте всю надосадочную жидкость.
- Повторно суспендируйте клеточную гранулу в смеси ДНК и перенесите в 4 мм электропорационные кюветы.
- Инкубировать при RT в течение 3 мин.
- Электропорация при 250 В, 900 мкФ.
- Немедленно ресуспендируйте клетки в предварительно нагретую (37 °С) полную среду с добавлением гентамицина и поместите их в 100-миллиметровую посуду.
- Инкубируйте трансфицированные клетки в течение ночи при 37 °C, 5%CO2.
- На следующее утро замените всю среду 10 мл бессывороточной среды для микроскопии (RPMI 1640 без фенола красного, 10 мМ HEPES, 1 мМ пирувата натрия, 50 мкМ β-меркаптоэтанола, 2 мМ L-глутамина).
2. Опсонизация эритроцитов
Примечание: В качестве модели мишени частиц для макрофагов используются эритроциты овец (SRBC). Обычно используется около 7 x 10 6 SRBC на чашку со стеклянным дном 35 мм.
- Промойте SRBC 100 μл 1x PBS (фосфатно-солевой буфер)/0,1% BSA (бычий сывороточный альбумин) и центрифугой (600 x g, 4 мин).
- После центрифугирования удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте SRBC в 100 мкл 1x PBS/0,1% BSA и центрифугуйте (600 x g, 4 мин).
- После центрифугирования отбраковать надосадочную жидкость и повторно суспендировать SRBC в 1x PBS/0,1% BSA с анти-SRBC IgG кролика в субагглютинизирующей концентрации. Используйте 500 мкл раствора, содержащего антитела/5 мкл SRBCs.
заметка: Субагглютинизирующая концентрация антител соответствует самой низкой концентрации, которая не индуцировала агглютинацию, обнаруженную как образование сети. В целом, субагглютинирующая концентрация составляет 8,2 мкг/мл.
- Определите концентрацию анти-SRBC IgG, необходимую для опсонизации SRBC, с помощью теста на гемагглютинацию. Последовательно разбавляйте анти-SRBC IgG (13,1 мг/мл) в диапазоне от 1/50 до 1/25 600 в микропланшете. Добавьте 2 x 106 SRBC в каждую лунку. Инкубируйте планшет в темноте при RT в течение нескольких часов.
- Инкубируйте при RT в течение 30 минут с медленным вращением.
- После двух промываний в 1x PBS/0,1% BSA, как описано выше, ресуспендируйте IgG-опсонизированные SRBC (IgG-SRBCs) в предварительно подогретой среде для микроскопии без сыворотки (2 мл/чашка).
3. Полилизиновое покрытие покровных стекол
- Тем временем обработайте посуду со стеклянным дном 35 мм 2 мл 0,01% поли-L-лизина в течение 30 минут при комнатной температуре.
- Вымойте посуду два раза 2 мл 1x PBS.
4. Нековалентная фиксация SRBC на стеклянных донных тарелках
- Налейте 2 мл суспензии SRBCs на стеклянное дно посуды диаметром 35 мм.
- Центрифуга с качающимся ротором при давлении 500 x g в течение 2 мин на стеклянную посуду со стеклянным дном 35 мм.
- Удалите надосадочную жидкость и умойтесь один раз 2 мл 1x PBS/10% BSA.
- Инкубируйте частицы в течение 30 минут с 2 мл 1x PBS/10% BSA на чашку.
- Вымойте посуду три раза 2 мл 1x PBS.
- Замените 1x PBS 2 мл предварительно подогретой (37 °C) среды для микроскопии без сыворотки.
5. Фагоцитоз, визуализированный с помощью TIRFM
- Микроскоп
заметка: TIRFM проводили с помощью микроскопа, оснащенного масляно-иммерсионным объективом (N 100X, NA1.49), нагревательной камерой с CO2 и двумя однофотонными камерами детектирования EMCCD (Electron Multiplying Charge Coupled Device) в паре с 1,5-кратным объективом.
- За день до сеанса микроскопа TIRF включите нагревательную камеру при температуре 37 ºC, чтобы обеспечить равномерный нагрев предметного столика микроскопа.
- Определение критического угла
заметка: Программное обеспечение ImageJ Color Profiler используется для обработки потоков изображений TIRF.
- Поместите под микроскоп чашку со стеклянным дном диаметром 35 мм, содержащую опсонизированный SRBC с бессывороточной средой для микроскопии.
- Соскребите клетки и повторно суспендируйте их в среде перед добавлением (100 - 500 мкл) в чашку.
- Используйте программное обеспечение "Live Acquisition" для управления микроскопом и выполнения возбуждения с помощью лазера с длиной волны 491 нм и/или 561 нм для идентификации клеток, экспрессирующих флуоресцентно помеченные белки.
- Определите клетку, которая экспрессирует флуоресцентно помеченные белки.
- Поместите его в центр поля и получите 500 изображений на одной длине волны возбуждения, с разными углами от 0º до 5º, с шагом 0,01º (рис. 1A). Углы автоматически изменяются системой микроскопа.
- Определите критический угол, позволяющий падающему свету полностью отражаться на границе раздела стекло/среда и генерировать затухающую волну. Используя программное обеспечение ImageJ Color Profiler, откройте последовательность изображений, нажав на «Файл», «Открыть» и выберите файл.
- Выберите область интереса (ROI) с помощью прямоугольного инструмента в ячейке с равномерной флуоресценцией (Рисунок 1B, желтый 1).
- Постройте среднюю интенсивность флуоресценции "Профиль оси Z", измеренную в ROI, с функцией углов по оси X, нажав на вкладку "Изображение", "Стопки" в выпадающем меню и "Построить профиль оси Z" (Рисунок 1B, красный 2).
Примечание: Критический угол – это угол, ведущий к максимальной флуоресценции перед резким снижением флуоресценции.
- Используйте любое значение угла на оси X, превышающее критический угол во время сеанса микроскопии, чтобы получить сигнал TIRF, как показано в примере 2.00 (рис. 1C).
- Приобретения
- Используя программное обеспечение Live Acquisition, настройте параметры сбора данных с помощью модуля «Редактор протоколов» (рис. 2A).
- Создание протокола с «петлей», состоящей из «многоканального захвата» для получения флуоресцентного сигнала от белков, представляющих интерес в области TIRF. Введите угол TIRF (например, 2,00), время экспозиции (например, 50 мс) и интенсивность лазера (например, 50%) (рис. 2B 1).
- Введите «Z-перемещение» объектива на 3 мкм над областью TIRF для получения регистрации сигнала в эпифлуоресценции с помощью инструмента «Многоканальность». Введите угол ниже критического угла (как в примере 1.00), время экспозиции (50 мс) и интенсивность лазера (50%) (рис. 2B, 2 и 3).
- Затем добавьте «z-образное перемещение» цели на 3 мкм ниже, чтобы вернуться в область TIRF (Рисунок 3B 4). Добавьте «снимок» ячейки в ярком свете светодиода (светоизлучающего диода) (рисунок 2В 5).
- Найдите интересующую клетку с умеренным уровнем экспрессии флуоресцентно меченного белка, которая инициирует фагоцитоз SRBC за счет удлинения плазматической мембраны вокруг частицы.
- Разместите его в центре поля.
- Начните потоковое захват 500 - 1 000 кадров. Во вкладке "Количество циклов" введите "750 кадров" (Рисунок 2B 1).
заметка: Программное обеспечение ImageJ Color Profiler используется для обработки потоков изображений TIRF.
- Откройте последовательность изображений в программе Image J, нажав «Файл», «Открыть» и выбрав файл.
- Разделите каналы, нажав на вкладку "Изображение", выпадающее меню "Гиперстеки" и на функцию "Стек в гиперстек". Заполните появившееся окно: Заказ: xyctz; Канал (c): количество каналов (например, "2", если у вас два флуорохрома); Срезы (z): количество срезов по оси z (например: "1", если по оси z нет движения); Кадры (t): количество изображений, разделенных на количество каналов; Режим отображения: Оттенки серого.
заметка: Генерируются две отдельные последовательности изображений, соответствующие двум разным каналам.
