Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.
1. Градиентная изоляция мононуклеарных клеток периферической крови человека (PBMC)
- Добавьте 25 мл гепаринизированной цельной крови в пробирку объемом 50 мл с помощью пипетки объемом 25 мл.
- Разбавьте клетки 25 мл фосфатно-солевого буфера (PBS).
- Добавьте 15 мл градиента плотности Фиколла-Пака в новую пробирку объемом 50 мл, и, наклоняя пробирку, очень медленно и осторожно добавьте 25 мл разбавленной клеточной суспензии над градиентом плотности так, чтобы не произошло смешивания цельной крови с градиентом плотности, т.е. не было нарушения границы раздела градиента крови и плотности.
- Центрифугирование суспензии с шага 1.2 при 400 × g в течение 30-40 мин в роторе качающегося ковша без тормоза с регулируемой температурой при 20 °C.
заметка: После центрифугирования должны быть видны три отдельных слоя: верхний слой — плазма; нижний прозрачный слой представляет собой градиент плотности Фиколла-Паке; и тонкий, средний клеточный слой, представляющий собой PBMC.
- Аспирируйте и отбраковывайте верхний слой путем отсасывания с помощью пастеровской пипетки, стараясь не нарушить межфазный слой мононуклеарных клеток (т.е. лимфоцитов, моноцитов и тромбоцитов).
- Аккуратно соберите этот слой мононуклеарной ячейки с помощью пипетки объемом 10 мл в новую центрифужную пробирку объемом 50 мл.
- Наполните пробирку 20 мл PBS, хорошо перемешайте и центрифугируйте при 300 × г в течение 10 мин при 20°C. После центрифугирования полностью удалите надосадочную жидкость.
- Повторно суспендируйте клеточную гранулу в 20 мл PBS и центрифугируйте при 200 × г в течение 10-15 мин при 20 °C. После центрифугирования полностью удалите надосадочную жидкость.
заметка: На этом этапе удаляются нежелательные тромбоциты в PBMC; Этот шаг можно повторить, чтобы обеспечить полное удаление тромбоцитов.
- Если отбор конкретных популяций не желателен, ресуспендируйте клеточные гранулы в лейкоцитарной полной среде (10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 1% L-глутамина и 1% пенициллин/стрептомицин в среде RPMI-1640) для культивирования после проведения подсчета клеток для суспендирования 1 мл среды на 107 PBMC перед переходом к следующему этапу.
2. Магнитное мечение популяций лейкоцитов
- Центрифугировать суспензию PBMC в дозе 300 × г в течение 10 мин и полностью аспирировать надосадочную жидкость.
- Ресуспендируйте клеточную гранулу в 80 мкл PBS на 107 клеток.
- Добавьте 20 мкл указанных магнитных шариков (т.е. магнитных шариков CD14 для выделения моноцитов, магнитных шариков CD4 для выделения Т-лимфоцитов) на 107 клеток.
- Хорошо перемешайте и выдерживайте в течение 15 минут при температуре от 2 до 8 °C в холодильнике.
- Добавьте 1-2 мл PBS на 107 клеток для промывки, и центрифугируйте при 300 × г в течение 10 мин.
- Полностью асасировать надосадочную жидкость и ресуспендировать до 108 клеток в 500 мкл PBS.
3. Магнитный отбор субпопуляций лейкоцитов
Примечание: Различные магнитные сепараторы и колонки доступны для выделения определенной популяции лейкоцитов по маркеру клеточной поверхности от ряда производителей. Изоляция может быть положительным отбором на основе одного или нескольких положительных маркеров или отрицательным отбором после истощения нежелательных популяций. Общий подход к проведению положительного отбора с использованием одного маркера (т.е. CD4 для Т-хелперных лимфоцитов или CD14 для моноцитов) изложен ниже.
- Подготовьте и заправьте магнитный сепаратор, включая разделительную колонну, в соответствии с инструкциями производителя.
- Поместите пробирку с образцом меченых PBMC. Предоставьте две центрифужные пробирки по 15 мл для сбора положительно меченых и немеченых клеточных фракций, следуя инструкциям производителя.
- Подсчитайте количество клеток и ресуспендируйте положительно отобранные лейкоциты (т.е. CD4+ Т-лимфоциты или CD14+ клетки) в лейкоцитарной полной среде, используя 1 мл среды на 107 клеток.
4. Окрашивание лейкоцитов карбоксифлуоресцеином сукцинимидиловым эфиром (CFSE) для оценки пролиферации
Примечание: CFSE широко используется в иммунологических исследованиях, как in vivo, так и in vitro. Наш протокол был оптимизирован для исследования in vitro взаимодействий МСК/ПБМК (или других лейкоцитов). Несмотря на то, что общие этапы, связанные с проведением маркировки CFSE in vitro, схожи, могут быть различия в конкретной дозе и сроках протокола. Это может быть связано с рядом факторов, т.е. конкретным типом используемой клетки, количеством используемых ячеек, которые, вероятно, могут повлиять на интенсивность флуоресцентного сигнала CFSE.
- Развести стоковый раствор CFSE (10 мМ) в PBS до требуемой рабочей концентрации 10 мкМ (рабочий раствор CFSE). Подготовьте 107 клеток (т.е. PBMC или Т-клетки) для мечения рабочим раствором CFSE.
- Центрифугировать при 300 × г в течение 10 мин до получения клеточной гранулы и аспирации надосадочной жидкости.
- Аккуратно суспендируйте клетки в 1 мл предварительно подогретого (37 °C) рабочего раствора CFSE и инкубируйте клетки в течение 10 минут при температуре 37 °C.
- Чтобы смыть избыток CFSE, разбавьте суспензию ячейки в 10 раз (по объему) предварительно охлажденной (4 °C) средой RPMI, содержащей 10% FBS. Отсадите клетки центрифугированием при 300 x g в течение 5 минут и выбросьте надосадочную жидкость. Промойте клеточную гранулу таким образом еще дважды.
- Повторно гранулируйте ячейки центрифугированием и подсчитайте количество ячеек. Ресуспендируйте 107 клеток (либо PBMC, либо Т-клеток) в 1 мл свежей предварительно подогретой лейкоцитарной полной среды.
5. Анализ подавления эффекторов Выбранные магнитными шариками, индуцированные МСК иммуномодулирующие лейкоциты на активированных CFSE-меченых эффекторных CD4 + Т-клетках
- Затравите МСК по 250 000 клеток в 3 мл полной среды MSC в 6-луночных планшетах (плотность МСК: 25 000 клеток/см2) для присоединения O/N в инкубаторе при температуре 37 °C, что позволит стволовым клеткам достичь 80% конфлюенции. Необходимо не менее 3 6-луночных планшетов, чтобы обеспечить достаточное количество PBMC, совместно культивируемых МСК, для отбора субпопуляций.
- Аспирируйте среду и добавляйте PBMC, разделенные в соответствии со стадией 1, но в 6-луночных планшетах со скоростью 2,5 x 106 клеток/лунку (плотность клеток: 250 000 лейкоцитов/см2) с 3 мл полной лейкоцитарной среды. Совместное культивирование в течение 48-72 часов в инкубаторе при температуре 37 °C.
- Специфическая популяция индуцированных МСК иммуномодулирующих лейкоцитов (т.е. CD14+ клеток) с помощью магнитных шариков в соответствии с разделами 2-3.
заметка: На этом этапе может быть выполнено внутриклеточное окрашивание цитокинов для проточного цитометрического анализа для оценки изменений профиля экспрессии цитокинов лейкоцитов, т.е. экспрессии интерлейкина-10-AS, модулируемого МСК.
- Добавляйте меченные CFSE аллогенные CD4+ Т-клетки, полученные в соответствии с разделами 2-4 в 24-луночных планшетах в 1 мл полной лейкоцитарной среды (плотность Т-клеток: 250 000 клеток/см2) к отобранным гранулами МСК-индуцированным лейкоцитам в различных соотношениях, т.е. 1:10, 1:5, 1:2 и 1:1 (между клетками).
- Чтобы стимулировать CD4+ Т-клетки, добавьте конъюгированные микрогранулы α-CD3/28 для получения соотношения гранул к клеткам 1:1.
- Для отрицательного контроля поместите 500 000 CD4+ Т-клеток/лунку в 24-луночный планшет (плотность Т-клеток: 250 000 клеток/см2) только с 1 мл полной среды лейкоцитов; для положительного контроля, в дополнение к осаждению того же количества CD4+ Т-клеток/лунку, добавьте α-CD3/28 конъюгированных микрогранул для получения соотношения гранул к клеткам 1:1.
- На3-е сутки ко-культуры оценивают пролиферацию меченых CFSE CD4+ Т-клеток (помещенных в пробирки с круглым дном) с помощью проточного цитометрического анализа с возбуждающими и эмиссионными фильтрами с длиной волны 488 нм, подходящими для флуоресцеина.