Исследование in vitro влияния стромальных клеток на рекрутирование лейкоцитов

Аннотация

Источник: Munir, H. et al., Анализируя влияние стромальных клеток на рекрутирование лейкоцитов из потока. J. Vis. Exp.(2015)

Видео демонстрирует метод исследования влияния стромальных клеток на рекрутирование лейкоцитов. В модели проточной камеры с параллельной пластиной провоспалительные цитокины индуцируют экспрессию рецепторов адгезии эндотелиальными клетками, способствуя привлечению и миграции нейтрофилов. Перекрестные помехи между стромальными клетками и эндотелиальными клетками уменьшают рекрутирование нейтрофилов в эндотелиальные клетки.

Протокол

Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.

1. Выделение и культивирование первичных эндотелиальных клеток человека и мезенхимальных стволовых клеток

1. Выделение и культивирование эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVEC):
   1. Положите пуповину на поднос с бумажными полотенцами и опрыскайте его 70% этанолом. Поместите в вытяжку для культуры тканей. Определите вену и канюляцию с обоих концов. Наденьте кабельную стяжку на канюлированный конец, чтобы закрепить его.
   2. Промойте венозную кровь фосфатно-солевым буфером (PBS) с помощью шприца. Наполните шприц воздухом и пропустите через вену, чтобы удалить и отбросить остатки PBS.
   3. Разморозьте 10 мг/мл коллагеназы типа Ia и разведите 1:10 в PBS (с хлоридом кальция и магния) до конечной концентрации 1 мг/мл. Пропустите раствор коллагеназы в вену до тех пор, пока обе канюли не будут заполнены. Закройте зажимы на канюлях с обоих концов.
   4. Накройте лоток салфеткой и сбрызните 70% этанолом. Поместите шнур в инкубатор на 20 минут при температуре 37 °C и 5% углекислом газе (CO₂).
   5. Выньте шнур из инкубатора и затяните кабельные стяжки. Аккуратно массируйте шнур в течение 1 минуты. Промойте клеточную суспензию 10 мл PBS и соберите в центрифужную пробирку объемом 50 мл.
   6. Наполните шприц воздухом и дважды пройдите через вену, чтобы удалить остатки PBS, собирая PBS в центрифужную пробирку объемом 50 мл, используемую на шаге 1.1.5. Центрифуга при 400 х г в течение 5 минут при комнатной температуре (RT).
   7. Надосадочная жидкость аспирата и ресуспендированная гранула в 1 мл полной среды эндотелиальных клеток (ЭК). Среда EC состоит из M199 с добавлением 35 мкг/мл гентамицина сульфата, 10 нг/мл эпидермального фактора роста человека, 1 мкг/мл гидрокортизона, 2,5 мкг/мл амфотерицина B и 20% эмбриональной сыворотки телят.
   8. Добавьте 4 мл среды EC и суспензию EC в колбу диаметром²⁵ см. Меняйте среду на следующий день, а затем каждые 2 дня.
   9. ECs демонстрирует булыжную морфологию (рис. 1Ai). Для анализа адгезии ЭК обычно засевают, когда они достигают 100% конфлюенции (см. Раздел 1.4).
2. Выделение мезенхимальных стволовых клеток желе Уортона (WJMSC) из пуповины человека:
   1. Выделите МСК, полученный из желе Уортона (WJMSC) из свежих пуповин или из пуповины, которая уже использовалась для выделения ЭК. Разрежьте пуповину на кусочки длиной 5 см. Разрежьте каждый кусочек в продольном направлении, чтобы показать кровеносные сосуды (2 артерии [белые, жесткие] и 1 вену [желтую, расширенную]).
   2. С помощью стерильных ножниц и щипцов удалите кровеносные сосуды и выбросьте. Разрезаем всю ткань на 2 - 3 мм³ части. С помощью щипцов поместите 2 - 3 мм³ штуки в центрифужную пробирку объемом 50 мл.
   3. Разморозьте 100 мг/мл стоковой коллагеназы типа II и разведите 1:100 в 10 мл PBS до конечной концентрации 1 мг/мл. Разморозьте 20 000 Ед/мл стоковой гиалуронидазы и разбавьте 1:400 до конечной концентрации 50 Ед/мл в растворе коллагеназы.
   4. Добавьте ферментативный коктейль в пробирку центрифуги, содержащую фрагменты ткани. Инкубируйте фрагменты ткани в течение 5 часов при 37 °C на медленном ротаторе.
   5. Развести клеточную суспензию в соотношении 1:5 в PBS. Поместите поровый фильтр 100 мкм в новую центрифужную пробирку объемом 50 мл. Вылейте клеточную суспензию на фильтр пор размером 100 мкм.
      заметка: Оставшиеся фрагменты тканей будут сохранены на фильтре, а клетки будут собраны в центрифужной пробирке объемом 50 мл.
   6. Выбросьте фильтр. Центрифугируйте клеточную суспензию при 400 x g в течение 10 мин в RT. Аспират надосадочная жидкость и ресуспендируйте гранулу WJMSC в 12 мл полной питательной среды WJMSC (модифицированная среда Dulbecco's Modified Eagle Medium, DMEM с низким содержанием глюкозы, 10% фетальная телячья сыворотка (FCS) и 100 ЕД/мл пенициллина + 100 мкг/мл стрептомициновой смеси).
   7. Засейте все клетки в колбу для культуры тканей размером 75 см². Смените среду через 24 часа с 12 мл полной питательной среды WJMSC. Заменяйте средство каждые 2 – 3 дня. Клетки должны достичь 70 - 80% конфлюенции в течение 2 недель. Проход, когда WJMSC достигает 70 - 80% слияния (см. раздел 1.4).
3. Расширение МСК костного мозга (BMMSC):
   1. Изолируйте МСК, полученные из костного мозга человека (BMMSC), как описано ранее. Добавьте 10 мл предварительно подогретых мезенхимальных стволовых клеток, среду для роста MSC (MSCGM) в центрифужную пробирку объемом 15 мл.
   2. Разморозьте флакон p2 BMMSC, поместив его на водяную баню при температуре 37 °C на 2 мин. Добавьте суспензию BMMSC в центрифужную пробирку, содержащую MSCGM. Хорошо перемешайте с помощью пипетки.
   3. Центрифугировать при 400 x g в течение 5 мин при RT. Полностью асасировать надосадочную жидкость.
   4. Ресуспендируйте клетки в 1 мл MSCGM и подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра или цифрового счетчика клеток, такого как целлометр.
   5. Засеять клетки в 75 см² культуральных колбы с плотностью 5 000 - 6 000 клеток на см² в 12 мл МСЦГ. Смените среду через 24 часа с 12 мл MSCGM. Скармливайте клетки по 12 мл MSCGM каждые 2 - 3 дня.
   6. Проход, когда BMMSC достигает 70 - 80% слияния (см. раздел 1.4). Клетки демонстрируют фибробластическую морфологию (рис. 1Aii).
4. Отряд ЭЦ и МСК:
   1. Аспиратная среда от 25 см 2 колбы культуры. Добавьте 2 мл 0,02% этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) примерно на 2 минуты. Аспирируйте ЭДТА и добавьте 2 мл трипсина (2,5 мг/мл). Смотрите под микроскопом до тех пор, пока клетки не станут круглыми.
   2. Коснитесь колбы, чтобы отсоединить ячейки. Инактивируйте трипсин путем добавления 8 мл питательной среды (в зависимости от типа клеток; EC-среду для HUVEC, DMEM LG для WJMSC и MSCGM для BMMSC) в колбу для культуры и переложите суспензию в центрифужную пробирку объемом 15 мл.
   3. Центрифугируйте при 400 x g в течение 5 мин. Аспиратируйте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу, как описано ниже.
      1. Для пассирования МСК повторно суспендируйте гранулу в питательной среде объемом 3 мл. Добавьте 11 мл питательной среды в три отдельных колбы по 2 отдельных культуральных колбы по⁷⁵ см. Добавьте 1 мл клеточной суспензии в каждую колбу для культур (расщепить 1:3). Проведите WJMSC и BMMSC 3 раза (p3) перед использованием в анализах совместной культуры.
      2. О посеве EC или MSC в анализах адгезии см. разделы 2 и 3.
5. Замораживание MSC:
   1. В проходе 3 отсоедините MSC, как описано в разделе 1.4. Аспират надосадочная жидкость и ресуспендия в 3 мл ледяного CryoSFM. Пипеткой 1 мл аликвот клеточной суспензии в ледяные криовиалы по 1,5 мл. Поместите криовалиалы в контейнер для заморозки.
   2. Храните контейнер при температуре -80 °C O/N. Переведите в жидкий азот. Разморозьте флакон с MSC (выполните шаги 1.3.1 - 1.3.6). Ресуспендируйте MSC в питательную среду объемом 5 мл (выберите подходящую среду для WJMSC или BMMSC) и высадите семена в колбу размером 25^см2.

2. Создание кокультур эндотелиально-мезенхимальных стволовых клеток на фильтрах

1. Отсоедините WJ или BMMSC, как описано в разделе 1.4. Повторно суспендируйте гранулу в 1 мл MSCGM. Проведите подсчет клеток с помощью гемоцитометра или целлометра.
2. Отрегулируйте объем так, чтобы конечная концентрация составляла 5 x 10⁵ MSC на 500 μл MSCGM.
3. С помощью стерильных щипцов перевернуть 6-луночные, 0,4 мкм ПЭТ фильтры Transwell и поместить в стерильную коробку.
4. Высадите 5 x 10⁵ MSC на внешнюю поверхность фильтров. Инкубируйте фильтры при 37 °C и 5%_CO2 в течение 1 часа.
5. Соберите фильтрующий материал с внешней поверхности фильтра. Посчитайте количество неприверженцев МСК в СМИ. Повторно инвертируйте фильтры с помощью стерильных щипцов и поместите их в соответствующую 6-луночную пластину, содержащую 3 мл MSCGM.
6. Добавьте 2 мл MSCGM на внутреннюю поверхность фильтра (рисунок 1B). Поместите в инкубатор при температуре 37 °C и 5%_CO2 на 24 часа. Трипсинизируйте слитую колбу 25^см2 с EC (рисунок 1Ai; как в разделе 1.4).
7. Ресуспендируйте EC в 8 мл MSCGM (1 x 25 см² колбы засеет четыре 6-луночных фильтра; ~5 x 10⁵ EC/фильтр). Аспирационная среда сверху и снизу пористые фильтры. Добавьте 3 мл свежего MSCGM в нижнюю камеру (под фильтром). Добавьте 2 мл суспензии EC на внутреннюю поверхность каждого фильтра. Инкубировать в течение 1 часа при 37 °C и 5% CO₂.
8. Аспирируйте среду для смывания неадгезивной КЭ и замените свежей МСЦГ. Установите параллельные монокультуральные фильтры ЕС путем засеивания ячеек на внутреннюю поверхность без предварительного засева МСК. Инкубируйте O/N при 37 °C и 5%_CO2.
9. Убедитесь, что монослой EC сливается и не содержит зазоров. Субсливающиеся монослои не могут быть использованы для анализа адгезии (Рисунок 1B).
10. Разморозьте 1 x 10⁵ Ед/мл стокового фактора некроза опухоли-альфа (TNFα) и разведите 1:1000 в MSCGM до конечной концентрации 100 Ед/мл (эквивалентно ~10 нг/мл). Проводите серийное разведение путем разбавления 100 Ед/мл TNFα на 1:10 в МСЦГ с получением 10 Ед/мл. Развести 10 Ед/мл TNFα в соотношении 1:10 в МСЦМГ с получением 1 Ед/мл.
11. Обработайте верхние и нижние камеры фильтров 1, 10 или 100 Ед/мл TNFα (эквивалентно ~10 нг/мл) при 37 °C в течение 4 часов перед анализом.

3. Выделение лейкоцитов

1. Возьмите венозную кровь у здоровых добровольцев и немедленно введите аликвоту в пробирки ЭДТА. Аккуратно переверните трубки для перемешивания.
2. Выложите 2,5 мл Histopaque 1077 на 2,5 мл Histopaque 1119 в тубу с круглым дном объемом 10 мл. Нанесите 5 мл цельной крови на градиент Histopaque. Центрифуга при 800 x g в течение 40 мин при RT.
3. Сбор периферических полиморфноядерных нейтрофилов (PMN) на границе раздела Histopaque 1077 и 1119 (над слоем эритроцитов). Поместите в тубу с круглым дном объемом 10 мл и замешайте до 10 мл PBSA. Аккуратно переверните пробирку и центрифугуйте при давлении 400 x g в течение 5 минут при RT.
4. Развести 7,5% раствор БСА 1:50 в 100 мл PBS (с хлоридом кальция и магния) до конечной концентрации 0,15% (мас./об.; PBSA). Аспират надосадочная жидкость и ресуспендия в 10 мл PBSA. Центрифугируйте при 400 x g в течение 5 мин при RT.
5. Ресуспендировать в 1 мл PBSA. Возьмите 20 мкл аликвоты клеточной суспензии и добавьте к 380 мкл PBSA (разведение 1:20). Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра или целлометра. Развести до необходимой концентрации (1 x 10⁶/мл для фильтров Transwell и микростекла Ibidi) в PBSA. Поддерживайте суспензию нейтрофилов на ЛТ до начала анализа.

4. Сборка системы потока

1. Настройте систему потока, как показано на рисунке 1C. Включите нагреватель и установите его на 37 °C. Прикрепите шприц на 20 мл (снимите поршень) и шприц на 5 мл к 3-стороннему крану. Прикрепите кран к камере из плексигласа с помощью ленты Micropore.
2. Измерьте и отрежьте длинный кусок силиконовой трубки толщиной 2/4 мм (толщиной), который примерно равен расстоянию между клапаном и 3-ходовым краном. Отрежьте кусок трубки длиной 8–10 мм (тонкой) толщиной 1/3 мм и вставьте его в один конец толстой трубки. Прикрепите толстую сторону трубки к 3-стороннему крану.
3. Подсоедините конец тонкой трубки к порту электронного 3-ходового микроклапана. Это и есть «промывочный резервуар». Отрежьте кусок толстой и тонкой трубки длиной 6 - 8 мм.
4. Вставьте тонкую трубку в один из концов толстой трубки. Прикрепите толстый конец трубки к шприцу объемом 2 мл (снимите поршень).
5. Подсоедините тонкий конец трубки шприца объемом 2 мл к порту на электронном микроклапане, чтобы получился «резервуар для образца». Подсоедините клапан к проточной камере фильтра, измерив и отрезав длинный кусок тонкой трубки, который представляет собой расстояние между микроклапаном и центром предметного столика микроскопа.
6. Для модели микрогорки прикрепите кусок толстой трубки диаметром 8–10 мм к концу тонкой трубки. Поместите L-образный соединитель на конец толстой трубки. Это соединится с микрослайдом. Для модели фильтра прикрепите кусок манометра Portex Blue Line диаметром 8–10 мм, соединяющий трубку с концом тонкой трубки.
7. Поместите тонкий конец трубки на микроклапан. Это общий выход для резервуаров для промывки и отбора проб. Наполните резервуары PBSA. Загрунтуйте трубки, пропустив через них PBSA, чтобы удалить пузырьки воздуха.
8. Прикрепите трубку Манометра к стеклянному шприцу диаметром 29 мм (50 мл). Подготовьте шприц, наполнив его 10 мл PBSA. Переверните шприц так, чтобы конец, соединенный с трубкой, был обращен вверх, и вытолкните все пузырьки воздуха. Долейте 5 мл PBSA.
9. Для модели с микропредметными стеклами прикрепите кусок толстой трубки толщиной 10 - 12 мм к концу трубки манометра, ведущей к стеклянному шприцу. Поместите L-образный соединитель на конец толстой трубки. Поместите стеклянный шприц в шприцевую помпу для инфузии/вывода.
10. Рассчитайте расход заправки (Q), необходимый для создания желаемого напряжения сдвига стенки (τ_вт в Паскале, Па) 0,1 Па (фильтры Transwell) или 0,05 Па (микрослайды Ibidi) с использованием следующих формул:
    γ_w = (6. Q) / (w.h²)
    τ = n.γ
    Где w = внутренняя ширина и h = внутренняя глубина проточного канала. n = вязкость протекающего раствора; PBSA равно n = 0,7 мПа.с. Для проточной камеры параллельного пластинчатого фильтра ширина (w) составляет 4 мм, а глубина (h) - 0,133 мм. Глубина камеры может незначительно варьироваться из-за различий в толщине используемой прокладки Parafilm. Для микрогорки Ibidi ширина составляет 3,8 мм, а глубина – 0,4 мм.
    заметка: Из-за различий в размерах проточного канала и динамике захвата мы используем разные напряжения сдвига для модели микрогорки по сравнению с моделью фильтра.

5. Настройка проточной камеры с параллельными пластинами с фильтрами

1. Вырежьте кусок парапленки (того же размера, что и стеклянный покровный лист) с помощью металлического шаблона. Вырежьте прорезь 20 x 4 мм в парапленке (для создания проточного канала) с помощью металлического шаблона. Используйте прокладку, чтобы отметить канал потока на стеклянном покровном колпачке.
2. Совместите края 6-луночного фильтра по стеклянной покровной крышке. Убедитесь, что фильтр закрывает разметку проточного канала. Аккуратно вырежьте фильтр с помощью скальпеля типа 10А.
3. Осторожно накройте фильтр прокладкой из парапленки, следя за тем, чтобы отверстие проточного канала находилось посередине фильтра (Рисунок 1D). Используйте кусочек чистой салфетки и выдавите все пузырьки.
4. Поместите покровное стекло в углубление нижней пластины проточной камеры Perspex. Расположите верхнюю пластину из плексигласа над верхней частью прокладки и завинтите пластины вместе (Рисунок 1D).
5. Поверните 3-позиционный кран, чтобы буфер промывки (PBSA) прошел через клапан. Подсоедините трубку манометра к входному отверстию верхней пластины из плексигласа. Пропустите PBSA через проточный канал, чтобы пузырьки могли пройти.
6. Подсоедините трубку манометра от шприцевого насоса к выходному отверстию пластины из плексигласа. Установите насос шприца на заправку и нажмите кнопку «Бег». Очистите все PBSA, которые капли на верхнюю пластину камеры.
7. Поместите камеру на предметный столик инвертированного фазово-контрастного микроскопа. Отрегулируйте фокус, чтобы визуализировать EC над фильтрами (рисунок 1B).

6. Перфузия лейкоцитов над эндотелиальными клетками

1. Поместите 2 мл очищенных нейтрофилов в резервуар для образца и оставьте нагреваться на 2 мин. Промойте эндотелий PBSA в течение 2 мин.
2. Включите клапан, чтобы перфузировать нейтрофилы над эндотелием. Вводите болюс нейтрофилов в течение 4 мин. Выключите вентиль и перфузируйте PBSA из промывочного резервуара до конца эксперимента.
3. Следите за тем, чтобы пузырьки воздуха не проходили через проточный канал ни в одной точке во время анализа, так как это нарушит монослой EC и вызовет отслоение адгезивных нейтрофилов.

7. Запись захвата и поведения нейтрофилов

1. Регистрируйте рекрутирование нейтрофилов либо во время потока нейтрофилов, либо после перфузии.
2. Все цифровые записи делайте не менее 5 - 10 полей в центре проточного канала. Определите центр канала, переместив объектив к краю канала на входном отверстии и определив середину порта.
   1. Для регистрации во время потока нейтрофилов делайте снимки одного поля каждые 10 секунд в течение 1 минуты. Двигайтесь по каналу и записывайте еще одно поле в течение 1 минуты. Повторяйте в течение всего болюса.
   2. Для регистрации постперфузии сделайте 10-секундные записи 5-10 полей вниз по центру проточного канала для оценки поведения лейкоцитов (обычно через 2 минуты после окончания болюса нейтрофилов). Делайте снимки каждую секунду с интервалом в 10 секунд. Это дает достаточно времени для анализа захвата из потока и поведения адгезивных нейтрофилов.
   3. Записывайте одно поле, содержащее не менее 10 трансмигрировавших нейтрофилов, в течение 5 минут, делая снимки каждые 30 секунд. Это может быть использовано для расчета скорости мигрирующих клеток (выше или ниже эндотелия).
   4. Запишите еще одну серию 10-секундных полей (обычно через 9 минут после перфузии). Это позволяет нейтрофилам мигрировать через эндотелиальный монослой.
   5. Остановите шприцевой насос и снимите трубку. Разберите проточную камеру и промойте резервуар для образца и трубки. Повторите эти действия для последующих фильтров/каналов микрослайдов.

8. Анализ пополнения и поведения лейкоцитов

1. Подсчитайте количество нейтрофилов в каждом поле во время 10-секундной записи в 2-минутном временном отрезке. Все ячейки должны присутствовать в первом-втором поле, чтобы их можно было подсчитать. Ячейки, которые частично находятся в поле с 2 сторон (например, верхняя/правая граница) поля зрения, включаются в подсчет, при условии, что они остаются в поле в течение полных 10 секунд.
2. Вычислите среднее количество адгезивных нейтрофилов на поле. Измерьте длину и ширину записываемого поля. Рассчитайте площадь поля. Посчитайте, сколько полей в 1 мм². Умножьте среднее количество нейтрофилов на количество полей в 1^мм2.
3. Рассчитайте общее количество перфузированных нейтрофилов, умножив количество перфузированных нейтрофилов (например, 2 x 10⁶/мл*Q [например, 0,0999 мл/мин для проточной камеры с параллельными планшетами]) на продолжительность болюса (например, 4 мин).
4. Разделите количество нейтрофилов/^мм2 на общее количество перфузированных нейтрофилов, чтобы определить общее количество адгезивных клеток (адгезивных клеток/мм2/10⁶ перфузированных).
5. Оцените, являются ли адгезивные нейтрофилы катящимися, прочно прилипшими или трансмигрировавшими.
   1. Вращающийся нейтрофил имеет фазовую яркость и медленно движется вдоль эндотелиального монослоя (1 - 10 мкм/сек).
   2. Прочно адгезивные клетки являются фазово яркими и связаны с поверхностью EC, либо остаются неподвижными (т.е. не двигаются во время записи), либо претерпевают изменение формы и мигрируют по поверхности EC (рис. 1Ei).
   3. Трансмигрировавший нейтрофил имеет темную фазу и находится ниже слоя EC (рисунок 1Eii).
6. Рассчитайте процент адгезивных клеток, которые являются катящимися, неподвижными и перемигрированными. В качестве альтернативы, поведение нейтрофилов может быть выражено в виде общего числа клеток, которые проявляют различное поведение, применяя ту же формулу, которая используется для расчета общей адгезии (как описано в шагах 8.6 - 8.7).
   1. Отметьте передний край катящегося нейтрофила. Отметьте передний край той же ячейки в конце 10-секундной последовательности. Проведите линию между 2 точками и измерьте расстояние, которое прошла клетка.
   2. Разделите это значение на продолжительность записи, в которой происходит скручивание ячейки (т. е. 10 секунд). Попробуйте выбрать нейтрофилы, которые находятся в поле в течение всего интервала в 10 секунд.
7. Для расчета скорости нейтрофилов, мигрирующих по поверхности (форма, измененная яркая фаза) или под эндотелием (темная фаза), используйте 5-минутную запись.
   1. Нарисуйте контур перенесенных клеток в начале последовательности и отслеживайте их перемещения по всей последовательности. Обратите внимание на положения центроида по осям X и Y с интервалом в 1 минуту для каждой ячейки. Вычтите значения позиций X и Y из первого изображения последовательности из значений на втором изображении. Это основано на теореме Пифагора.
   2. Вычтите значения со второго изображения из третьего изображения. Сделайте это для всех изображений в последовательности. Возведите в квадрат значения X и Y и сложите их вместе.
   3. Извлекаем полученное значение из квадратного корня. Вычислите скорость для каждой ячейки путем усреднения скоростей, вычисленных на каждом минутном интервале. Отслеживаем 10 мигрировавших нейтрофилов и вычисляем среднюю скорость.

Результаты

Рисунок 1. Определение совместного культивирования EC-MSC и анализ рекрутирования нейтрофилов с использованием анализа адгезии на основе потока. (A) Микрофотография (i) первичной EC и (ii) пассажа 3 BMMSC, выращенных на колбах для культуры тканей. (B) Микрофотография EC и MSC, культивируемых на 6-луночных фильтрующих вставках Transwell. (C)

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Коллагеназа типа Ia	сигма	С2674	Разбавьте в 10 мл PBS до получения конечной концентрации 10 мг/мл. Хранить при -20°C в 1 мл аликвот.
PBS Дульбекко	сигма	Д8662	С кальцием и хлоридом магния. Хранить стерильно и при комнатной температуре.
1X Средний M199	Gibco	31150-022 (Английский)	Перед применением подогреть на водяной бане 37 °C.
Гентамицина сульфат	сигма	Г1397	Хранить при температуре 4°C. Добавьте в бутылку M199 объемом 500 мл.
Эпидермальный фактор роста человека	сигма	Е9644	Хранить при температуре -20°C в аликвотах 10 мкл.
Фетальная сыворотка теленка (ССК)	сигма	Ф9665	FCS должна быть протестирована партиями, чтобы убедиться в росте и жизнеспособности изолированного EC. Нагревайте при инактивации при 56°C. Хранить в аликвотах по 10 мл при -20°C.
Амфотерицин В	Gibco	15290-026	Сильнодействующий и становится токсичным в течение недели, поэтому свежую полноценную среду HUVEC необходимо восполнять каждую неделю. Хранить при температуре -20°C в аликвотах по 1 мл.
гидрокортизон	сигма	Н0135	Запас в этаноле. Хранить при температуре -20°C в аликвотах 10 мкл.
Коллагеназа II типа	сигма	С6885	Развести бульон в PBS до конечной концентрации 100 мг/мл. Хранить при -20°C в 100 мкл аликвот.
Гиалуронидаза	сигма	Н3631	Развести исходный материал в PBS до конечной концентрации 20 000 ед/мл. Хранить при -20°C в 100 мкл аликвот.
Клеточное сетчатое фильтр 100 мкм для пробирки 50 мл	Расходные материалы для научных лабораторий (SLS)	No 352360 (Английский	Также можно использовать другие коммерчески доступные клеточные фильтры (например, Greiner bio-one).
DMEM с низким уровнем глюкозы	Биосера	ЛМ-Д1102/500	Перед применением подогреть на водяной бане 37 °C.
Смесь пенициллина/стрептомицина	сигма	П4333	Хранить при температуре -20°C в аликвотах по 1 мл.
Колба для культуры тканей 25 см2	Технология SLS	353109
Колба для культуры тканей 75 см2	Технология SLS	353136
Флакон с мезенхимальными стволовыми клетками костного мозга	Лонза	ПТ-2501	Хранить в жидком азоте по прибытии. По прибытии камеры находятся в проходе 2, но обозначены как проход 0. Выложить до пассажа 3 и хранить в жидком азоте для последующего использования.
Среда для роста мезенхимальных стволовых клеток (MSCGM)	Лонза	ПТ-3001	Перед применением подогреть на водяной бане 37 °C. Для окрашивания Cell Tracker Green используйте среду без FCS.
Решение ЭДТА (0,02%)	сигма	Е8008	Хранить при температуре 4°C. Перед использованием нагреть на водяной бане при температуре 37°C.
Раствор трипсина	сигма	Т4424	Хранить при температуре -20°C в аликвотах по 2 мл. Разморозьте при комнатной температуре и используйте сразу.
Криовиальные операции	Грайнер биоуан	2019-02	Держите на льду перед добавлением клеточной суспензии.
Морозильный контейнер Mr. Frosty	Налген	5100-0001	Хранить при комнатной температуре. При добавлении криовиалы с ячейками хранить при -80°С в течение 24 ч до трансфрирования клеток в жидкий азот.
Клеточный трекер зеленый краситель	Технологии жизни	С2925	Хранить в аликвотах 5 мкл при -20°C. Разбавить в 5 мл предварительно подогретого (до 37°C) MSCGM.
Камеры для подсчета ячеек	Nexcelom	СД-100	В качестве альтернативы можно использовать гемоцитометр.
Счетчик элементов Cellometer auto T4	Nexcelom	Авто Т4-203-0238
Фактор некроза опухоли α (TNFα)	Системы НИОКР	210-ТА-100	Развести исходный материал в PBS до конечной концентрации 100 000 ед/мл. Хранить при -80°C в 10 мкл аликвот.
6-луночные фильтры ПЭТ Transwell 0,4 мкм	Технология SLS	353090 (Английский
K2-EDTA в тубах 10 мл	Сарштедт		Хранить при комнатной температуре.
Histopaque 1119	сигма	No 11191	Хранить при температуре 4°C. Перед использованием нагреть до комнатной температуры.
Histopaque 1077	сигма	10771 Номер 10771	Хранить при температуре 4°C. Перед использованием нагреть до комнатной температуры.
Туба с круглым дном 10 мл	Эпплтон Вудс	SC211 142 АС
7,5% раствор BSA Fraction V	Технологии жизни	15260-037	Хранить при температуре 4°C.
Шприцы Plastipak 20 мл	BD сокол	300613
Шприцы Plastipak 5 мл	BD сокол	302187
Шприцы Plastipak 2мл	BD сокол	300185
Гипоаллергенная хирургическая лента 3М 9м х 2,5см	Микропоры	1530-1	Используйте для фиксации шприца постукивающим стуком по стенке камеры из плексигласа.
Трубка из силиконовой резины, внутренний диаметр/внешний диаметр (ID/OD) 1/3 мм (тонкая трубка)	Научный центр Фишера	FB68854	Отрежьте силиконовые трубки соответствующего размера. Все трубки, ведущие непосредственно к электронному микроклапану, должны быть тонкими.
Внутренний диаметр трубки из силиконовой резины 2/4 мм (толстая трубка)	Научный центр Фишера	FB68855
Трубка манометра Portex Blue Line	Кузнецы	200/495/200	Трубка, ведущая к шприцевому насосу.
3-х ходовой запорный кран	БОК Охмеда АБ
Стеклянный шприц 50 мл для помпы	Микромат Поппера	550962	Перед использованием необходимо загрунтовать, удалив пузырьки воздуха.
Стеклянный покровный колпак	Рэймонд Агнец		Покровные накладки 26x76 мм на заказ. Номер лота 2440980.
Парапленочная прокладка	Американская национальная баночная компания		Отрежьте кусок парапленки размером 26x76 мм с помощью алюминиевого шаблона и прорежьте в нем паз 20x4 мм с помощью скальпеля 10a. Толщина прокладки составляет примерно 133 мкм.
Две параллельные пластины из плексигласа	Лаборатория прикладных технологий Вольфсона		Специально разработанная камера, состоящая из параллельных пластин, скрепленных 8 винтами. Нижняя пластина имеет прорезь для смотра, вырезанную посередине, и неглубокую выемку, фрезерованную для обеспечения места для покровного стекла, фильтра и прокладки. Верхняя пластина из плексигласа имеет входное и выпускное отверстие, расположенное над проточным каналом.
Электронный 3-ходовой микроклапан с минимальным мертвым пространством	Ли Продактс Лтд.	LFYA1226032H	Электронно подключен к источнику питания постоянного тока 12 В.
Шприцевой насос для инфузии/вывода (PHD2000)	Гарвардский аппарат	70-2001	Установите диаметр на 29 мм и скорость наполнения (потока).
L-образный соединитель	Лабхут	ЛЭ876	Чтобы прикрепить впускные и выпускные отверстия к микрослайдовому каналу Ibidi.
видеокамера	Qimaging	01-ЦИЦ-Ф-М-12-С	Подключается к компьютеру, который позволяет записывать видео с оцифровкой.
Имидж-Про Плюс 7.0	Медиа Кибернетика	41Н70000-61592	Для анализа данных. Вручную помечайте ячейки, отображающие различное поведение. Трековые ячейки для анализа скоростей качения и миграции.

) гг. ) гг. гг.