$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Индукция старения химиотерапевтическими препаратами в культивируемых раковых клетках
ПРИМЕЧАНИЕ: Все шаги по работе с клетками в этом разделе должны выполняться в шкафу биобезопасности с использованием стерильных методов. Этот раздел написан для типов адгезивных клеток. Суспензионные элементы могут быть использованы с соответствующими модификациями, как указано выше.
- Выращивание линий раковых клеток в соответствии со стандартным протоколом поставщика или лаборатории, предоставившей конкретную используемую клеточную линию.
заметка: Клетки с низким пассажем (p < 10), как правило, предпочтительны, поскольку в образцах необработанных клеток будут наблюдаться более низкие уровни репликативного старения, т.е. более низкий фон.
- За сутки до индукции старения лекарственными препаратами соберите клетки с трипсином-ЭДТА 0,25% (или в соответствии с рекомендациями). Нейтрализуйте трипсин, добавив равный объем полной питательной среды, и перенесите клеточную суспензию в стерильную коническую трубку><.
заметка: Для суспензионных клеток этот шаг не нужен.
- Подсчитайте клетки с помощью стандартного метода гемацитометра и запишите клетки/мл. Пластинчатые клетки при 1 × 103-10 × 103 ячейки/см2 в стандартных 6-луночных пластиковых чашках для культивирования.<бр/>
заметка: Оптимальная плотность покрытия зависит от скорости пролиферации клеток и должна определяться пользователем. Клетки должны находиться в логарифмической фазе роста примерно на 10-20% конфлюенции на момент лечения (т.е. после 18-24-часовой инкубации после посева). Начальная плотность (клеток/мл) суспензионных клеток должна определяться пользователем. Шестилуночные планшеты обычно дают достаточно стареющих клеток на лунку для одного стандартного образца для анализа проточной цитометрии. При сортировке потоком следует использовать гораздо большую площадь поверхности (например, несколько планшетов P150), чтобы обеспечить восстановление достаточного количества стареющих клеток для последующих анализов (≥1 × 106).
- Инкубируйте гальванизированные клетки в течение ночи (18-24 ч) в инкубаторе с температурой 37 °C с 5%CO2 и поддоном для влажности.
- Обрабатывайте покрытые клетки химиотерапевтическими препаратами, вызывающими старение. Включите по крайней мере один положительный контроль, например, этопозид (ETO) или блеомицин (BLM). Подготовьте дублирующие лунки для каждого препарата. Включите один набор, обработанный только транспортным средством в качестве управления.
заметка: Кривая дозы для каждого экспериментального агента должна быть протестирована пользователем для определения оптимальной концентрации для индукции старения в используемой клеточной линии (линиях).
- Инкубируйте клетки в течение 4 дней в инкубаторе с температурой 37 °C и 5%CO2 и поддоне для влажности, чтобы дать возможность начать старение. Ежедневно исследуйте ожидаемые морфологические изменения с помощью светового микроскопа.
заметка: Время инкубации от 3-5 дней может быть приемлемым в зависимости от скорости наступления старения. Среда может быть изменена, а агент может быть применен повторно (или нет), по желанию, чтобы способствовать здоровым условиям роста при достижении приемлемого процента стареющих клеток.
- После наступления старения собирают клетки, добавляя трипсин-ЭДТА 0,25% в течение 5 мин при 37 °С. Когда клетки диссоциируют в суспензию, нейтрализуют трипсин равным объемом полной среды.
заметка: Этот шаг не нужен для клеток, растущих во взвешенном состоянии. Если будет проводиться окрашивание поверхностными маркерами, избегайте использования трипсина-ЭДТА, так как он может временно разрушать поверхностные антигены на клетках. Вместо этого аккуратно диссоциируйте монослой с помощью стерильного пластикового скребка для клеток (или альтернативного реагента для диссоциации, предназначенного для сохранения поверхностных антигенов).
- Подсчитайте клетки в каждом образце с помощью гемацитометра. Рассчитайте количество клеток/мл для каждого образца.
заметка: Трипановый синий может быть добавлен для оценки процента мертвых клеток на этом этапе (т.е. из-за медикаментозного лечения), но гибель клеток также будет определяться с помощью флуоресцентного красителя жизнеспособности во время процесса окрашивания DDAOG.
- Аликвота ≥0,5 × 106 ячеек на образец в микроцентрифужные пробирки объемом 1,7 мл.<бр/>
заметка: Количество клеток в образце должно быть стандартизировано для всех образцов.
- Центрифугируйте пробирки в течение 5 мин при 1 000 × г в микроцентрифуге при 4 °C. Удалите надосадочную жидкость.
заметка: Если охлаждаемая микроцентрифуга недоступна, может быть приемлемо проведение центрифугирования при температуре окружающей среды для определенных типов упругих клеток.
- Перейдите к окрашиванию DDAOG в разделе 2.
2. DDAOG-окрашивание SA-β-Gal в образцах клеток
- Разведите 1 мМ бафиломицина А1 в соотношении 1:1000x в среде DMEM (без FBS) до конечной концентрации 1 мкМ.
- Добавить приготовленный раствор Baf-DMEM в образцы клеточных гранул (с шага 1.11) в концентрации 1 ×10 6 клеток/мл.<бр/>
заметка: Например, при использовании 0,5 × 106 клеток на образец, добавьте 0,5 мл Baf-DMEM.
- Инкубировать в течение 30 минут при 37 °C (без CO2) на ротаторе/встряхивателе, установленном на низкой скорости.
заметка: Избегайте инкубаторов сCO2 в процессе окрашивания, которые могут подкислить растворы и тем самым помешать окрашиванию Baf и DDAOG.
- Не промывая, добавьте исходный раствор DDAOG (5 мг/мл) в соотношении 1:500x (10 мкг/мл в конечную концентрацию). Пипеткой перемешать. Замените на ротаторе/встряхивателе при температуре 37 °C (без CO2) на 60 минут. Беречь от прямых солнечных лучей.
- Центрифугируйте пробирки в течение 5 минут при температуре 1 000 x g при 4 °C. Удалите надосадочную жидкость.
- Промойте 1 мл ледяного 0,5% BSA на пробирку и пипетку для смешивания. Центрифугируйте пробирки в течение 5 минут при 1 000 x g при 4 °C и удалите надосадочную жидкость. Повторите этот шаг 2 раза, чтобы тщательно промыть ячейки. Удалите надосадочную жидкость и продолжите.
заметка: Важно выполнить этапы промывки, описанные в шаге 2.6, чтобы удалить необработанный DDAOG, который может проявлять нежелательное флуоресцентное излучение (460/610 нм).
- (Опционально) Фиксация и хранение окрашенных DDAOG клеток для последующего анализа
- Добавьте 0,5 мл ледяного 4% параформальдегида по каплям на каждый промытый образец. Пипеткой перемешать.
- Выдерживать 10 минут при комнатной температуре.
- Промойте ячейки 2 раза 1 мл PBS.
- Храните образцы до 1 недели при температуре 4 °C перед анализом проточной цитометрии.
заметка: Для фиксированных образцов пропустите шаг 2.8.
- Разбавьте запас Calcein Violet 450 AM (1 мМ) в соотношении 1:1,000x до 1% BSA-PBS (1 мкМ конечный). Добавьте 300 мкл (для образцов культивируемых клеток) в промытые клеточные гранулы на шаге 2.6. Инкубировать в течение 15 минут на льду в темноте.
- Перейдите к настройке проточной цитометрии (раздел 3).
3. Настройка проточного цитометра и сбор данных
- Перенесите образцы клеток в пробирки, совместимые с прибором для проточной цитометрии. Поместите трубки на лед и держите их защищенными от света.
заметка: Если в клеточных суспензиях наблюдаются агрегаты, перед анализом пропустите суспензию через клеточные сетчатые фильтры с плотностью 70-100 мкм. Не используйте ситечки размером 40 мкм, так как они могут исключить некоторые из более крупных стареющих клеток.
- В указанном программном обеспечении (см. Таблицу материалов) откройте следующие графики: 1) точечная диаграмма FSC-A против SSC-A, 2) гистограмма фиолетового канала, 3) дальний красный канал (например, APC-A) против зеленого канала (например, FITC-A) точечная диаграмма.
заметка: Также можно использовать графики исключения дублетов и одноканальные гистограммы, но это не является строго обязательным.
- Инициируйте сбор данных цитометра.
- Поместите контрольный образец, предназначенный только для автомобиля, окрашенный DDAOG, на впускное отверстие. При низкой скорости забора начните сбор данных о пробах.
- Отрегулируйте напряжения FSC и SSC таким образом, чтобы >90% событий содержались в графике. Если ячейки плохо помещаются на графике, уменьшите настройку масштабирования области до 0,33-0,5 единиц.
- Удалите образец, предназначенный только для автомобиля, без записи данных.
- (Необязательно) Добавьте одну каплю радужных калибровочных микросфер в пробирку цитометра с 1 мл PBS. Поместите трубку на входное отверстие цитометра. Начните сбор образцов данных.
- Отрегулируйте напряжение фиолетового, зеленого и дальнего красного каналов таким образом, чтобы верхний пик радужной микросферы находился в диапазоне 104-105 единиц относительной флуоресценции в каждом канале, а все пики были хорошо разделены в каждом канале. Рекордные 10 000 событий. Извлеките трубку.
- Поместите положительный контрольный образец (например, BLM, ETO), окрашенный DDAOG, на впускное отверстие. На низкой скорости соберите данные образца. Наблюдайте за событиями в FSC, SSC, фиолетовом, зеленом и дальнем красном каналах, чтобы убедиться, что более 90% событий содержится на всех графиках. Обратите внимание на увеличение сигнала AF и DDAOG по сравнению с управлением только автомобилем.
- Если вы используете сортировочный цитометр, начните сортировку на этом этапе.
- В целях ведения учета необходимо записать 10 000 ячеек для контрольного образца и каждого отсортированного образца.
- Отсортируйте желаемое количество клеток (обычно подходит ≥1 ×10, 6) в подходящую для инструмента пробирку для сбора с 3-5 мл питательной среды.
- После сортировки приступайте к последующему культивированию или анализу.
заметка: Для калиброванного проточного цитометра, используемого в настоящем документе, оптимальные напряжения в канале обычно находятся в диапазоне от 250 до 600 (средний диапазон), но оптимальные напряжения и диапазоны напряжения в канале будут варьироваться в зависимости от прибора. Избегайте использования напряжений в очень низких или высоких диапазонах, которые могут подавить сигнал или усилить шум.
- Выполнив шаги 3.1-3.5 и внеся необходимые коррективы в настройки цитометра, запишите данные по всем образцам. Убедитесь, что настройки остаются одинаковыми для всех образцов записей. Запишите ≥10 000 событий на образец культивируемой клетки.
заметка: Несмотря на то, что стробирование и анализ могут быть выполнены с помощью программного обеспечения для сбора данных (например, FACSDiva), полный рабочий процесс стробирования и анализа, который должен быть выполнен после сбора данных с использованием отдельного программного обеспечения для анализа (FlowJo), описан в разделе 4 ниже. Анализ после сбора данных является предпочтительным, чтобы сократить время работы на рабочем месте цитометра и воспользоваться дополнительными инструментами, включенными в специальное программное обеспечение для анализа.
- Сохраните образцы данных в формате .fcs. Экспортируйте файлы на рабочую станцию, оснащенную программным обеспечением для анализа проточной цитометрии (например, FlowJo).
4. Анализ данных проточной цитометрии
ПРИМЕЧАНИЕ: Представленный рабочий процесс использует программное обеспечение FlowJo. Альтернативное программное обеспечение для анализа данных проточной цитометрии может быть использовано при аналогичном выполнении ключевых шагов, описанных в этом разделе.
- Используя программное обеспечение FlowJo, откройте файлы данных .fcs из шага 3.7.
- Откройте окно макета.
- Перетащите все образцы в окно макета.
- Затвор жизнеспособных клеток.
- Сначала дважды щелкните образец данных для элемента управления, предназначенного только для автомобиля, чтобы открыть окно данных.
- Визуализируйте данные в виде гистограммы фиолетового канала. Определите жизнеспособные клетки, окрашенные CV450, на основе их более яркой флуоресценции, чем у мертвых клеток.
- Нарисуйте гейт с помощью инструмента гистограммы с одним вентилем, чтобы включить в него только жизнеспособные клетки. Назовите ворота жизнеспособными.
- Затем из окна макета образца перетащите жизнеспособный вентиль на другие образцы ячеек, чтобы равномерно применить стрип.
- В окне макета визуализируйте все образцы в виде гистограмм фиолетового канала (жизнеспособности). Прежде чем продолжить, убедитесь, что жизнеспособное клеточное гейтирование подходит для образцов; Если нет, внесите необходимые коррективы.
заметка: Окрашивание жизнеспособности может различаться в зависимости от лечения.
- Стареющие клетки ворот.
- Дважды щелкните данные закрытой жизнеспособной ячейки, чтобы управление только автомобилем открыло окно данных.
- Визуализируйте данные в виде точечной диаграммы для дальнего красного канала (DDAOG) и зеленого канала (AF).
- Нарисуйте ворота с помощью инструмента стробирования прямоугольника, включив в него <5% ячеек, которые являются DDAOG+ и AF+ (верхний правый квадрант). Назовите ворота стареющими.
- Затем в окне макета образца перетащите стареющий вентиль на жизнеспособные подмножества других образцов клеток, чтобы равномерно применить вентил.
- В окно макета перетащите все жизнеспособные подмножества ячеек, указанные в разделе 4.4. Визуализируйте все жизнеспособные образцы в виде точечных диаграмм с красным (например, APC-A) и зеленым каналом (например, FITC-A).
- Убедитесь, что стареющий затвор, нарисованный на шаге 4.5.3, виден на всех участках и что на заслонке для управления только транспортным средством присутствует ≤5%-10% стареющих клеток.
- После того, как процент стареющих клеток был определен с помощью описанных выше шагов, представьте полученные данные с помощью графиков FlowJo, обобщите их в таблице данных и/или проанализируйте статистически с помощью стандартного программного обеспечения.