$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Приготовление реагентов
- Среда желчных солей: Для приготовления триптического соевого бульона (БТС), содержащего 0,4% солей желчных кислот (масса/объем), ресуспендировать 200 мг солей желчных веществ в 50 мл автоклавного соевого бульона. Фильтр стерилизует с помощью фильтра 0,22 мкм. Вносите свежий средний раз в неделю. <чел/>
примечания: Обычно используемые желчные соли представляют собой смесь холата натрия и дезоксихолата натрия в соотношении 1:1, выделенных из желчного пузыря овец и коровьего пузыря. Как было показано ранее, присутствие глюкозы было необходимо для образования биопленки, вызванной желчными солями. БГБ содержит глюкозу по сравнению с бульоном Лурии-Бертани (ЛБ); и, следовательно, был достаточным для индуцирования образования биопленки в шигелле и других анализируемых кишечных патогенах. В зависимости от бактерий, подлежащих анализу, могут потребоваться разные концентрации глюкозы или разные потребности в сахаре.
- 0,5% мас.% кристаллического фиалки в воде: Растворите 2,5 г кристаллического фиалки в 500 мл дистиллированной воды. Фильтр простерилизовать с помощью фильтра 0,22 мкм.
2. Подготовка бактерий
- Выращивайте в течение ночи культуры исследуемых штаммов бактерий путем инокуляции 3 мл TSB одной, хорошо изолированной колонией в стерильной пробирке для культивирования. Инкубировать при 37 °C с встряхиванием при 225 об/мин для ночной инкубации (16 - 24 ч).
заметка: Стрейны следует извлекать из морозильных запасов каждые 2-4 недели и хранить на тарелках не старше 2 недель.
3. Твердофазный анализ адгезии
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот анализ количественно определяет количество адгезивных бактерий с использованием метода 96-луночных планшетов. Бактерии выращиваются статически в плоских донных пластинах. Промывка производится для удаления неприлипших бактерий, а прилипшие бактерии окрашиваются кристаллическим фиолетовым цветом. Кристаллический фиолетовый краситель связывается с пептидогликаном в клеточной стенке бактерии и может быть солюбилизирован с помощью этанола. Количество адгезивных бактерий определяется на основе удержания кристаллической фиалки.
- Установите две пробирки объемом 1,5 мл. Этикетка TSB или TSB + желчные соли (BS).
- Добавьте 1 мл TSB или TSB + BS в соответствующие пробирки.
- Инокулируйте в пробирки 20 μл ночного посева (в разведении 1:50).
- В стерильный, прозрачный, с плоским дном, обработанный культурой тканей 96-луночный планшет добавьте 130 мкл/лунку неинокулированной контрольной среды в три лунки, чтобы они служили пустым контролем. Настройте три контрольные лунки для каждого типа тестируемого фильтрующего материала (TSB и TSB + BS).
- Добавьте 130 мкл/лунку инокулированной культуры в три лунки и повторяйте до тех пор, пока все условия эксперимента не будут покрыты в трех количествах.
- Инкубировать в течение 4 - 24 ч при статической температуре 37 °C.
- С помощью считывателя пластин запишите внешний диаметр600. Установите контрольные лунки в положение «пустые». Убедитесь, что контрольная среда прозрачная без признаков мутности. Если обнаружено какое-либо помутнение, откажитесь от эксперимента. Значения OD600 могут быть использованы для нормализации данных, если существуют значительные различия в скорости роста между штаммами бактерий.
- Удалите питательную среду с помощью вакуумной линии, осторожно наклоняя планшет и медленно отсасывая среду у нижнего края лунки. Обязательно соберите всю питательную среду, не нарушая прилипшую бактериальную популяцию, расположенную на пластиковой поверхности. Если во время инкубации образовался матрикс из внеклеточных полисахаридов (EPS), матрикс будет визуализирован в виде белого осадка. Не беспокойте матрицу EPS.
- Аккуратно промойте лунки один раз 200 мкл стерильного фосфатно-солевого буфера (PBS). Удалите промойку PBS с помощью вакуумной линии.
- Переверните тарелку для высыхания. Дайте высохнуть минимум 20 минут.
заметка: Поскольку биопленка должна быть тщательно просушена перед окрашиванием, протокол можно приостановить на этом этапе на несколько часов или даже на ночь. Дополнительное время высыхания не изменит процедуру окрашивания, в то время как неполное высыхание повлияет на количественную оценку результатов и воспроизводимость.
- Добавьте 150 мкл 0,5% кристаллического фиолетового в каждую опытную и контрольную лунку.
- Инкубировать в течение 5 минут при комнатной температуре (RT).
- Один раз промойте лунки 400 μл дистиллированной воды. Добавленный объем помогает удалить остаточное хрустальное фиолетовое пятно со стенок лунок. Снимите стирку с помощью вакуумной линии.
- Промойте лунки пять раз 200 μл дистиллированной воды. Удалите стирку с помощью вакуумной линии.
заметка: Тщательная промывка важна для количественной оценки. Когда глухие лунки очистятся от дистиллированной воды и не содержат остатков кристаллического фиолетового пятна, приступайте к следующему этапу.
- Переверните тарелку в сухое, защищенное от света место. Обеспечьте полное высыхание пластины, как указано выше.
- Обеспылите лунки 200 μл 95% этанола. Выдержите тарелку в шейкере в течение 30 минут. Чтобы избежать испарения, особенно при высоких температурах, выполняйте этот этап при температуре 4 °C.
- С помощью считывателя пластин запишите оптическую плотность на 540 (наружный диаметр540).
заметка: Длина волны для максимального поглощения кристаллического фиолетового составляет около 590 нм. В литературе сообщается о диапазоне от OD540 доOD 595 для поглощения кристаллического фиолета; Таким образом, выберите доступную длину волны в зависимости от считывателя пластин.