1. Приготовление реагентов
- Среда для желчных солей (BS): Для приготовления триптического соевого бульона (TSB), содержащего 0,4% желчных солей (вес/объем), ресуспендировать 200 мг желчных солей в 50 мл автоклавного TSB. Фильтр простерилизовать с помощью фильтра 0,22 мкм. Готовьте свежий средний раз в неделю.
примечания: Обычно используемые желчные соли представляют собой смесь холата натрия и дезоксихолата натрия в соотношении 1:1, выделенных из желчного пузыря овец и коровьего пузыря. Как было показано ранее, присутствие глюкозы было необходимо для образования биопленки, вызванной желчными солями. БГБ содержит глюкозу по сравнению с бульоном Лурии-Бертани (ЛБ); и, следовательно, был достаточным для индуцирования образования биопленки в шигелле и других анализируемых кишечных патогенах. В зависимости от бактерий, подлежащих анализу, могут потребоваться разные концентрации глюкозы или разные потребности в сахаре.
- 0,5% мас.% кристаллического фиалки в воде: Растворите 2,5 г кристаллического фиалки в 500 мл дистиллированной воды. Фильтр простерилизовать с помощью фильтра 0,22 мкм.
- Конканавалин А (КонА) конъюгированный с флуоресцеином изотиоцианатом (ФИТК): Восстановите исходное сырье в 1x PBS. Разбавьте концентрированное вещество 10 мг 400 мкл 1x PBS до конечной концентрации 25 мкг/мл и беречь от света.
- PBS + глюкоза: Растворите 0,2 г глюкозы в 10 мл 1x PBS (2% по сравнению с конечным содержанием глюкозы). Фильтр простерилизовать с помощью фильтра 0,22 мкм. Внесите свежий в день использования.
- PBS + желчные соли: Растворите 40 мг в 10 мл 1x PBS (0,4% по сравнению с желчными солями в конечном итоге). Фильтр простерилизовать с помощью фильтра 0,22 мкм. Внесите свежий в день использования.
- PBS + глюкоза и желчные соли: Растворите 40 мг желчных солей и 0,2 г глюкозы в 10 мл 1x PBS (0,4% по массе желчных солей и 2% по сравнению с глюкозой в конечном итоге). Фильтр простерилизовать с помощью фильтра 0,22 мкм. Внесите свежий в день использования.
- Подготовьте агаровые пластины LB.
- Фиксация формальдегида/глутарового альдегида: Добавьте 810 мкл формальдегида (37% исходный раствор, 3% конечная концентрация) и 125 мкл глутарового альдегида (25% исходный раствор, 0,25% конечная концентрация) в 14 мл 1x PBS. Тщательно перемешайте и храните при температуре 4 °C. Фикс должен быть холодным для правильного использования.
осторожность: Фиксация токсична и требует утилизации опасных отходов.
- Раствор для защиты от выцветания: используйте раствор для защиты от выцветания, содержащий краситель 4,6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) для ингибирования фотообесцвечивания образцов иммунофлуоресцентной микроскопии при флуоресцентном окрашивании ДНК бактерий.
2. Подготовка бактерий
- Выращивайте в течение ночи культуры исследуемых штаммов бактерий путем инокуляции 3 мл TSB одной, хорошо изолированной колонией в стерильной пробирке для культивирования. Инкубировать при 37 °C с встряхиванием при 225 об/мин для ночной инкубации (16 - 24 ч).
заметка: Стрейны следует извлекать из морозильных камер каждые 2-4 недели и хранить на тарелках не старше 2 недель.
3. EPS Обнаружение матрицы
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти бесплатные анализы количественно оценивают и визуализируют EPS. В обоих случаях ЭПС обнаруживается с помощью лектина для связывания полисахаридов. Флуоресцентно-конъюгированный белок позволяет проводить количественное определение.
- Полуколичественное определение ЭПС
- Установите две пробирки объемом 1,5 мл. Этикетка с TSB или TSB + BS.
- Добавьте 1 мл TSB или TSB + BS в соответствующие пробирки.
- Инокулируйте в пробирки 20 мкл ночной культуры (разведение 1:50).
- В стерильный, черный, плоскодонный, обработанный культурой тканей 96-луночный планшет добавьте 130 мкл/лунку неинокулированной контрольной среды в три лунки, чтобы они служили пустым контролем. Установите три контрольные скважины для каждого типа испытываемой среды. Добавьте в лунки 130 л/лунку инокулированной культуры и повторяйте до тех пор, пока все условия эксперимента не будут покрыты в трех размерах.
- Инкубировать в течение 4 - 24 ч при статической температуре 37 °C.
- Перенесите питательную среду на прозрачную 96-луночную пластину с помощью пипетки, в идеале многоканальную пипетку. Будьте осторожны, чтобы собрать всю питательную среду, не нарушая адгезивную популяцию и/или пенополистирол, расположенный на пластиковой поверхности. Откладывать.
- Зафиксируйте черную пластину на 15 минут при RT, используя 200 μл/лунку формальдегида/глутаральдегида в 1x PBS.
- Пока адгезивная популяция фиксируется, оцените фракцию надосадочной жидкости из шага 1.1.6. С помощью считывателя пластин запишите внешний диаметр600. Установите контрольные лунки в положение «пустые». Убедитесь, что контрольная среда прозрачная без признаков мутности. Если обнаружено какое-либо помутнение, откажитесь от эксперимента.
- В качестве альтернативы, весь анализ может быть выполнен в черной прозрачной нижней пластине. В этих обстоятельствах могут быть записаны значения наружного диаметра600, а питательная среда может быть впоследствии отброшена до перехода к шагу 3.1.7. Значения OD600 могут быть использованы для нормализации данных в случае существенных различий в скорости роста между штаммами бактерий.
- Снимите фиксацию и утилизируйте вместе с опасными отходами.
- Аккуратно промойте лунки дважды 200 μл/лунка стерильным PBS. Удалите промойку PBS с помощью вакуумной линии, осторожно наклонив пластину и медленно отсасывая смывку у нижнего края лунки.
- Добавьте 150 μл/лунку 25 μг/мл ConA-FITC и инкубируйте в течение 15 минут при RT.
- Аккуратно дважды промойте 200 μл PBS.
- Добавьте 150 μL PBS в каждую лунку. Зарегистрируйте флуоресценцию на длине волны 488 нм.
