1. Приготовление реагентов
- Среда желчных солей: Для приготовления триптического соевого бульона (БТС), содержащего 0,4% солей желчных кислот (масса/объем), ресуспендировать 200 мг солей желчных веществ в 50 мл автоклавного соевого бульона. Фильтр простерилизовать с помощью фильтра 0,22 мкм. Готовьте свежий средний раз в неделю.
примечания: Обычно используемые желчные соли представляют собой смесь холата натрия и дезоксихолата натрия в соотношении 1:1, выделенных из желчного пузыря овец и коровьего пузыря. Как было показано ранее, присутствие глюкозы было необходимо для образования биопленки, вызванной желчными солями. БГБ содержит глюкозу по сравнению с бульоном Лурии-Бертани (ЛБ); и, следовательно, был достаточным для индуцирования образования биопленки в шигелле и других анализируемых кишечных патогенах. В зависимости от бактерий, подлежащих анализу, могут потребоваться разные концентрации глюкозы или разные потребности в сахаре.
- 0,5% мас.% кристаллического фиалки в воде: Растворите 2,5 г кристаллического фиалки в 500 мл дистиллированной воды. Фильтр стерилизует с помощью фильтра 0,22 мкм.
- Фосфатно-солевой буфер (PBS) + глюкоза: Растворите 0,2 г глюкозы в 10 мл 1x PBS (2% по сравнению с конечным содержанием глюкозы). Фильтр стерилизует с помощью фильтра 0,22 мкм. Внесите свежий в день использования.
- PBS + желчные соли: Растворите 40 мг в 10 мл 1x PBS (0,4% по сравнению с желчными солями в конечном итоге). Фильтр простерилизовать с помощью фильтра 0,22 мкм. Внесите свежий в день использования.
- PBS + глюкоза и желчные соли: Растворите 40 мг желчных солей и 0,2 г глюкозы в 10 мл 1x PBS (0,4% по массе желчных солей и 2% по сравнению с глюкозой в конечном итоге). Фильтр стерилизует с помощью фильтра 0,22 мкм. Внесите свежий в день использования.
- Подготовьте агаровые пластины LB.
2. Подготовка бактерий
- Выращивайте в течение ночи культуры исследуемых штаммов бактерий путем инокуляции 3 мл TSB одной, хорошо изолированной колонией в стерильной пробирке для культивирования. Инкубировать при 37 °C с встряхиванием при 225 об/мин для ночной инкубации (16 - 24 ч).
заметка: Штаммы следует повторно извлекать из морозильных камер каждые 2-4 недели и хранить на тарелках не старше 2 недель.
3. Дисперсионный анализ
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом анализе обнаруживается разрушение биопленки за счет бактериальной дисперсии. Здесь устанавливаются зрелые биопленки и впоследствии (обычно на следующий день) среды заменяются на PBS или дополненные PBS. Затем оценивают надосадочный компонент для количественного определения количества бактерий, которые диссоциировали от биопленки.
- Установите две пробирки объемом 1,5 мл. Маркировка TSB или TSB + BS (желчные соли).
- Добавьте 1 мл TSB или TSB + BS в соответствующие пробирки.
- Инокулируйте в пробирки 20 μл ночного посева (в разведении 1:50).
- В стерильный, прозрачный, с плоским дном, обработанный культурой тканей 96-луночный планшет добавьте 130 мкл/лунку неинокулированной контрольной среды в три лунки, чтобы они служили пустым контролем. Настройте три контрольные лунки для каждого типа тестируемого фильтрующего материала.
- Добавьте 130 μл/лунку инокулированной культуры в три лунки и повторяйте до тех пор, пока все условия эксперимента не будут покрыты в трех количествах.
- Инкубируйте планшет в течение 4 - 24 часов при температуре 37 °C статически.
- Прежде чем продолжить, нагрейте PBS, PBS + глюкоза, PBS + желчные соли и PBS + желчные соли + глюкоза до 37 °C. Ежедневно готовьте эти реагенты в свежем виде.
- С помощью считывателя пластин запишите оптическую плотность, наружный диаметр600. Установите контрольные лунки в положение «пустые». Убедитесь, что среда прозрачная без признаков помутнения. Если обнаружено какое-либо помутнение, откажитесь от эксперимента. Значения OD600 могут быть использованы для нормализации данных, если существуют значительные различия в скорости роста между штаммами бактерий.
- Удалите питательную среду с помощью вакуумной линии. Обязательно соберите всю культуральную среду, не нарушая прилипшую популяцию, расположенную на пластиковой поверхности.
- Аккуратно промойте лунки дважды 200 μл/лунка стерильным PBS. Удалите промойку PBS с помощью вакуумной линии.
- Замените промывку 130 μл/лунка следующего состава на три лунки в каждой: PBS, PBS + глюкоза, PBS + желчные соли и PBS + желчные соли + глюкоза. Эти реагенты должны быть предварительно подогреты до 37 °C.
- Инкубируйте планшет в течение 30 минут при температуре 37 °C.
- Осторожно извлеките пластину из инкубатора при температуре 37 °C. Переложите надосадочную жидкость в свежий стерильный 96-луночный планшет.
- Используя 96-луночный планшет или блок разведения, приготовьте 10-кратное (1:10) последовательное разведение надосадочной жидкости в стерильные PBS.
заметка: Серия разведения должна варьироваться от неразбавленного до 10-6 в зависимости от штамма тестируемой бактерии. Для определения оптимального диапазона разведения могут быть проведены пилотные эксперименты.
- Нанесите 5 мкл каждого разведения на LB-агар с помощью многоканальной пипетки. Инкубировать при температуре 37 °C в течение ночи. Подсчитайте колонии на следующий день и учитывайте фактор разведения при определении восстановительных колониеобразующих единиц (КОЕ). Чтобы рассчитать процент дисперсии относительно 1x PBS (установлен на 100%), разделите восстановительный КОЕ из каждого условия обработки на восстановительный КОЕ из 1x контрольного образца PBS.
заметка: Также можно использовать обычные медиа-планшеты для интересующего штамма бактерий. Например, шигелла может быть нанесена на конголезские красные пластины. Убедитесь, что пластины сухие для соответствующих техник точечного покрытия.
