$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Приготовление биопленки in vitro бактерий на колонии грибов
- Центрифугируйте бактериальную культуру при давлении 5000 x g в течение 3 мин и суспензируйте гранулу в 25 мл стерильного 0,1 М калийфосфатного буфера (25 г/л KH2PO4 и 2,78 г/л K2HPO4, pH 5,8). Повторите этот шаг один раз и отрегулируйте конечную концентрацию бактерий до 109 клеток/мл с тем же буфером.
- Заполните микропланшет на 6 лунок 5 мл бактериальной суспензии (или стерильным 0,1 М буфером фосфата калия для отрицательного контроля).
- Разрежьте целлофановую мембрану грибковой культуры стерильным бритвенным лезвием, чтобы получить квадраты целлофана с одной колонией гриба на каждой мембране. С помощью щипцов осторожно удалите целлофановые квадраты, содержащие гифы, из твердой среды и перенесите квадрат целлофана, содержащий гифы, в лунку микропланшета, содержащего бактериальную суспензию.
- Осторожно встряхните микропланшет, пока колонии грибов еще прикреплены к целлофану; затем удалите листы целлофана, оставив колонии грибов в пластине.
- Инкубировать микропланшет при щадящем перемешивании (~60 об/мин) при температуре, адаптированной к изучаемым микроорганизмам.
заметка: Время инкубации зависит от скорости зарождения биопленки и стадии анализа. P. fluorescens BBc6/L. bicolor инкубировать при 20 °C в течение 30 мин для получения биопленок на ранних стадиях и до 16 ч для получения зрелых биопленок.
2. Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия анализ образования биопленки
- Подготовка образцов
- Для удаления планктонных бактерий и бактерий, электростатически прикрепленных к гифам, промойте грибок, перенеся его на новую 6-луночную микропластину, заполненную 5 мл крепкого раствора соли (NaCl, 17 г/л); осторожно встряхните в течение 1 минуты.
- Перенесите грибок в новую 6-луночную микропланшет, содержащую 5 мл стерильного 0,1 М калий-фосфатного буфера, осторожно встряхните в течение 2 минут и перенесите гриб в свежий калий-фосфатный буфер.
- Разрежьте скальпелем часть колонии гриба, которую необходимо изобразить, сохраняя ее в буфере с фосфатом калия, таким образом, чтобы полученный участок содержал около половины колонии гриба.
- Чтобы окрасить образец, перенесите его в чашку Петри, наполненную стерильной водой, содержащей соответствующий флуоресцентный краситель (в зависимости от цели анализа), и инкубируйте в темноте.
- Для визуализации грибковой сети используйте, например, Congo Red (конечная концентрация 0,1%, 5 мин инкубации), агглютин зародышей пшеницы (WGA), конъюгированный с Alexa Fluor 633 (конечная концентрация 10 мкг/мл, 10 мин инкубации) или FUN1 (конечная концентрация 10 мкм, 10 мин инкубации).
- При использовании бактерии с нефлуоресцентной меткой проведите противодействие бактериальным клеткам с помощью ДНК-специфичного флуоресцентного зонда среди многочисленных коммерчески доступных красителей для проникновения в клетки. Например, используют DAPI (конечная концентрация 0,25 мкг/мл, 10 мин инкубации).
- Чтобы визуализировать белки матрицы, используйте белковый краситель.
- После окрашивания промойте образец, переложив его на крышку чашки Петри, содержащую 10 мл стерильного 0,1 М фосфата калия, и осторожно встряхните в течение 1 минуты.
- Наполовину погрузите горку в крышку чашки Петри и осторожно доведите срезанную часть до того, чтобы она плавала над горкой. Затем медленно извлеките предметное стекло из буферного раствора, дав образцу аккуратно осесть на предметное стекло.
заметка: На этом этапе очень важно действовать осторожно, чтобы избежать повреждения биопленки.
- Наконец, добавьте к образцу 10 μл монтажной среды, предотвращающей выцветание, и накройте его стеклянным покровным стеклом.
заметка: После того, как предметное стекло подготовлено, микроскопический анализ должен быть проведен как можно скорее (в течение не более 30 минут), чтобы избежать изменения структуры биопленки.