Анализ миграции резидентных Т-клеток в различных областях опухоли в режиме реального времени с помощью конфокальной микроскопии

Аннотация

Источник: Peranzoni, Elisa, et al. ex vivo визуализация резидентных CD8 Т-лимфоцитов в срезах опухоли легкого человека с помощью конфокальной микроскопии. J. Vis. Exp. (2017).

Это видео описывает визуализацию резидентных инфильтрирующих опухоль CD8 Т-клеток, меченных флуоресцентно связанными антителами в срезах опухоли легкого человека. Этот метод позволяет анализировать миграцию CD8 Т-клеток в режиме реального времени с помощью конфокальной микроскопии.

Протокол

1. Иммуноокрашивание резидентных CD8 Т-клеток и опухолевых клеток

1. Развести антитела (конечная концентрация 10 мкг/мл) и ядерный краситель (конечная концентрация 1 мкг/мл) в среде RPMI-1640 без фенола ред.<бр/> заметка: Используйте антитела с флуоресцентной связью anti-CD8 (мышиный IgG, клон SK1) и анти-EpCAM (молекула адгезии эпителиальных клеток) (мышиный IgG HEA-125) для мечения CD8 Т-лимфоцитов и опухолевых эпителиальных клеток соответственно. Используйте антитела против CD90/Thy1 с флуоресцентной связью (мышиный IgG, клон 5E10) для мечения фибробластов и активированных эндотелиальных клеток. Используйте 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) для мечения ядра клеток с нарушенной плазматической мембраной с целью оценки жизнеспособности тканей.
2. Извлеките планшеты для культивирования из инкубатора и с помощью пипетки отсосите жидкость из нержавеющей стали. Не удаляйте среду RPMI-1640 объемом 1,1 мл, помещенную под вкладыши для клеточных культур.
3. Не прикасаясь к срезу и с помощью наконечника пипетки, добавьте 40 мкл раствора, содержащего антитела, на каждый срез опухоли.
4. Инкубируйте планшет при 37 °C в течение 15 минут, чтобы обеспечить окрашивание антителами.
5. Тонкими щипцами снимите шайбы, выньте ломтики и опустите их на 10 с в среду RPMI-1640 без фенолового красного. Поместите срезы обратно на вкладыши для клеточных культур и добавьте каплю среды RPMI-1640, не содержащей фенола, красного цвета, на каждый отдельный ломтик. Выдерживайте температуру на плите при температуре 37 °C в течение 10 минут. Приступаем к визуализации.

2. Визуализация и анализ миграции резидентных CD8 Т-клеток в срезах опухоли легкого человека

ПРИМЕЧАНИЕ: Конфокальный микроскоп, используемый в этом протоколе, представляет собой вертикальный вращающийся диск, оснащенный 25-кратным объективом для погружения в воду (25x/0,95 N.A.).

1. Подготовка настройки микроскопа
   1. За несколько часов до начала сеанса визуализации установите температуру термокамеры микроскопа на уровне 37 °C.
   2. Настройте систему для постоянной перфузии опухолевых срезов насыщенной кислородом (5% CO₂, 95%_O2) феноловой средой RPMI, не содержащей красных красных (рис. 1). С помощью перистальтического насоса подайте перфузионный фильтрующий материал в камеру визуализации и отасуньте раствор в колбу для сбора отходов.
   3. Запустите перистальтический насос, чтобы насыщенный кислородом раствор прошел через перфузионные трубки.
2. С помощью тонких щипцов выньте срез из 6-луночного планшета и перенесите его в пластиковую чашку диаметром 35 мм, заполненную средой RPMI, не содержащей фенола красного. Иммобилизуйте срез с помощью анкера для среза диаметром 19,7 мм с расстоянием между нитями 2 мм. Поместите чашку Петри на предметный столик микроскопа. Подсоедините входной и выходной наконечники системы перфузии. Включите систему перфузии и установите скорость потока среды на 0,8 мл/мин.
3. Опустите цель погружения в воду на срез. Сфокусируйтесь на верхней части среза с помощью яркого полевого света. Используя подходящий флуоресцентный свет, выберите интересующую область, содержащую CD8 Т-клетки, опухолевые островки (положительные на EpCAM) и область стромы (положительную на CD90). Проверьте жизнеспособность клеток в пределах среза, оценив окрашивание DAPI на поверхности разреза и вглубь ткани.
   Здоровый срез содержит лишь меньшинство DAPI-положительных клеток на расстоянии нескольких микрон от поверхности разреза.
4. Установите сеанс визуализации, выполнив следующие действия.
   1. В зависимости от интенсивности флуоресцентного сигнала 3 флуорофоров установите время экспозиции от 50 до 800 мс и интенсивность лазера от 20 до 40%.
   2. Выберите толщину стека z для изображения в пределах опухолевого среза.
      заметка: Здесь было захвачено 10-12 оптических плоскостей, охватывающих общую глубину 60-70 мкм в размерности z.
   3. Выберите начальную позицию примерно на 10 мкм ниже первых меченых CD8 Т-клеток.
   4. Определите временной интервал между каждым изображением z-стека от 10 до 30 с и общее время записи от 10 до 30 минут.

Результаты

Рисунок 1: Фотографии перфузионной системы. А) Безфеноловый раствор RPMI обогащен 5%_CO2, 95%_O2. Б) Затем раствор перфузируется перистальтическим насосом. C) Раствор RPMI поступает в чашку для культивирования через входное отверстие. На выходе раствор отсасывается насосом из камеры в контейнер для отходов. Обратите внимание, что аспирационный наконечник установлен на уровне, опре...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Вертикальный конфокальный микроскоп	Лейка	Рекомендуется использовать конфокальный вращающийся диск
Программное обеспечение Imaris	Битовая плоскость		Это программное обеспечение используется для визуализации изображений и отслеживания миграции Т-клеток
Тонкие щипцы	Мировые прецизионные приборы	14142
30 мм Вставки для культур	Многородность	PICM0RG50
Мемориальный институт Розуэлл Парк (RPMI) средний, добавка GlutaMAX	ТермоФишер	61870010	Полная RPMI-среда изготавливается путем добавления 10 % термоинактивированной эмбриональной сыворотки теленка и пенициллина/стрептомицина
Фосфатно-солевой буфер (PBS)	ТермоФишер	20012019
Сбалансированный солевой раствор Хэнкса (HBSS)	Инвитроген	14170088
Низкая температура гелеобразования Agarose, тип VII-A	Сигма-Олдрич	А0701
Нетоксичный бутилцианоакрилатный клей, Vetbond	3 МИН.	1469
Нарезные анкеры, диаметр 19,7, расстояние между нитями 2 мм	Уорнер Инструментс	64-1415
Шайбы из нержавеющей стали, внутренний диаметр 5 мм	амазонка	B004K1FDGQ
BV605-конъюгированный анти-CD8 (клон SK1)	BD Biosciences	565289
FITC-сопряженный анти-EpCAM (клон HEA-125)	Милтеньи Биотек	Тел.: 130-098-113
BV510-конъюгированный анти-CD90 (клон 5E10)	Биолегенда	328125
4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI	ТермоФишер	Д1306

г. гг.