ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол подчеркивает использование проточной цитометрии FRET для обнаружения активности посева биологических образцов мыши. Он также совместим с рекомбинантными фибриллами и биологическими образцами человека. Эвтаназия мышей и извлечение мозга проводились в соответствии с процедурами, одобренными IACUC.
1. Извлечение мозга
- После глубокой анестезии изофлураном (2%) перфузируйте мышь ледяным PBS, содержащим 0,03% гепарина, и извлекайте мозг в соответствии с деталями, описанными в Gage et al.
- Поместите извлеченную ткань в криопробирку и заморозьте, поместив в жидкий азот. В качестве альтернативы можно заморозить салфетку на сухом льду. После замораживания перенесите салфетку при температуре -80 °C и при необходимости храните в течение длительного периода времени><.
заметка: Этот протокол совместим с гомогенатами всего мозга или микрорасчлененными областями мозга. См. Хагихара и др.для подробного протокола микродиссекции.
2. Подготовка биологического семенного материала
- Приготовьте гомогенизационный буфер путем растворения ингибиторов протеазы (этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) свободно) в 1x TBS (трис-буферный физиологический раствор, 1 таблетка на 10 мл). Завихрить энергично, и хранить на льду. Ингибиторы протеазы должны быть свободны от ЭДТА, чтобы сохранить жизнеспособность биосенсорных клеток.
- Взвесьте замороженную ткань мозга в одноразовой лодке для взвешивания и переложите в коническую пробирку объемом 5 мл. Добавьте ледяной гомогенизационный буфер так, чтобы конечный раствор составлял 10% веса/объема. Временно хранить на льду. Масса ткани и объем буфера для последующей гомогенизации будут варьироваться в зависимости от размера мозга и/или используемых областей. Здесь взрослую мышь hemibrain весом 0,2 г суспензируют в 2 мл для получения 10% раствора по объему.
- Перенесите образцы в холодное помещение, а ультразвуковой аппарат зонда настройте на соответствующие настройки. Для ультразвуковой обработки зондом с помощью Omni Ruptor (показано здесь) установите мощность на 20%, что соответствует примерно 75 Вт. Используйте импульсный режим, чтобы гарантировать, что образцы не перегреваются во время ультразвуковой обработки. Установите генератор на 30%, что соответствует примерно 500 мс.
- Очистите наконечник ультразвукового зонда, промыв водой, изопропанолом и еще раз водой, протирая зонд между каждым раствором. Обязательно промойте и протрите боковые стороны и дно зонда лабораторными салфетками.
- Работая с одним образцом за раз, погрузите наконечник зонда в гомогенизационный буфер и запустите ультразвуковую терапию. Используя описанные выше настройки мощности и генератора, подайте 25 импульсов. Следите за тем, чтобы ткань полностью находилась во взвешенном состоянии. Будьте осторожны, чтобы не допустить вспенивания образца на этом этапе.
заметка: Образцы подвержены пенообразованию, если а) общий объем мал или б) гомогенат нагревается. С помощью этого конкретного прибора не следует проводить ультразвуковую обработку с объемами менее 250 μл. Чтобы обеспечить охлаждение образцов, пробирки можно хранить на льду во время этого этапа.
- Очистите зонд, стерев остатки лизата, затем введите 10 импульсов в стакан с чистой водой. Промойте боковые стороны и дно зонда водой, изопропанолом и еще раз водой (как в шаге 2.4), вытирая насухо между каждым шагом. Во избежание загрязнения тщательно промойте зонд между образцами.
заметка: Что касается тау-агрегатов, мы не обнаружили, что для предотвращения загрязнения от образца к образцу требуются более строгие методы очистки. Другие амилоиды, однако, могут требовать дополнительного ухода, который был подробно описан в литературе.
- Храните гомогенаты на льду до тех пор, пока не будут обработаны все образцы.
- Гомогенизирует спин при 21 300 x g в течение 15 мин при 4 °C.
- Переложите надосадочную жидкость в чистую пробирку, стараясь не потревожить гранулы. Выбросьте гранулы. Аликвотируйте надосадочную жидкость, и храните лизаты при температуре -80 °C для дальнейшего использования. Однако избегайте циклов замораживания/оттаивания гомогенатов, так как это снижает эффективность посева.
3. Реплакирование биосенсорных ячеек
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте четыре клеточные линии для этого анализа: HEK 293T (клеточная линия #1), RD-P301S-CFP (клеточная линия #2), RD-P301S-YFP (клеточная линия #3) и RD-P301S-CFP/YFP (клеточная линия #4). В таблице 1 указан вклад каждой клеточной линии в анализ.
- В стерильных условиях используйте аспирацию питательной среды. Промойте клетки теплым фосфатно-солевым буфером (PBS) и аспирируйте. Трипсинизируйте клетки (3 мл трипсина-ЭДТА (0,05%)) в течение 3 мин, погасите теплой питательной средой (9 мл DMEM, 10% фетальная бычья сыворотка (FBS), 1% пенициллин/стрептомицин, 1% GlutaMax) и немедленно перенесите клетки в коническую трубку.
- Центрифугируют клетки при давлении 1000 x g в течение 5 мин в среде RT. Аспиратную среду и ресуспендируют клеточную гранулу в теплой питательной среде.
- С помощью гемоцитометра определяют плотность клеток для каждой клеточной линии. Плотность клеток будет варьироваться в зависимости от слияния во время сбора и объема ресуспензии. Ресуспендируйте клетки, собранные из 10-сантиметровой чашки, при 90% конфлюенции в 10 мл среды, чтобы плотность клеток составила примерно 1 миллион клеток/мл.
- Сделайте мастер-смесь ячеек + среда таким образом, чтобы каждая лунка 96-луночного планшета содержала 35 000 клеток в среде объемом 130 мкл (например, чтобы получить мастер-смесь на 100 лунок, ресуспендируйте 3,5 млн клеток в среде объемом 13 мл). Измените номер ячейки в соответствии с индивидуальным планом эксперимента и временными шкалами. Для обработки клеток через ~18 часов после нанесения покрытия добавьте 35 000 клеток в каждую лунку 96-луночного планшета.
- С помощью многоканальной пипетки медленно пипетируйте 130 мкл суспензии Master mix cell в каждую лунку с плоским дном, обработанным культурой тканей 96-луночным планшетом. Во время нанесения покрытия поместите наконечник пипетки в центр лунки, не касаясь дна пластины.
заметка: Хотя формат покрытия может быть изменен, рекомендуется делать n = 4 лунки для каждой из клеточных линий по 1-3 на пластину. Остальная часть пластины (n = 84) зарезервирована для клеточной линии #4 (биосенсорные клетки).
- Дайте клеткам отстояться, оставив планшет в покое в течение 10 минут при RT. Инкубируйте O/N при 37 °C, 5%CO2 и относительной влажности ≥80%.
4. Лечение клеток
ПРИМЕЧАНИЕ: На следующий день, когда тау-биосенсорные клетки сливаются на 60-65%, приготовьте комплексы для трансдукции семян следующим образом:
- В одной пробирке смешайте реагент для трансфекции, такой как липофектамин, с питательной средой с пониженным содержанием сыворотки, такой как Opti-MEM, чтобы получить мастер-смесь. В каждую лунку добавьте 1,25 мкл трансфекционного реагента и 8,75 мкл редуцированной сыворотки среды. Осторожно перемешайте трубку, кратковременно убавьте обороты и инкубируйте в течение 5 минут при RT.
- В другой пробирке соедините семенной материал (аликвоту лизата из шага 2.9) с восстановленной сывороткой.
заметка: Объем семенного материала будет варьироваться в зависимости от конкретного эксперимента. При выборе объема семян учитывайте: обилие семян в образце и потенциальную токсичность. Сырые гомогенаты могут быть токсичными для клеток. Таким образом, используйте минимально возможную громкость, чтобы контролировать желаемый эффект. Ранее испытанные объемы лизата/лунки варьируются от 1-5 μл, что соответствует 5-20 μг общего белка. Следите за тем, чтобы общий объем на лунку (семена + среда с восстановленной сывороткой) составлял 10 мкл.
- Смешайте содержимое из двух пробирок, описанных в пунктах 4.1 и 4.2, осторожно перемешайте, кратковременно открутите (1000 x g, 5 секунд) и инкубируйте при RT в течение от 20 минут до 2 часов.
- Аккуратно пипеткой нанесите 20 мкл трансдукционного комплекса на боковую сторону отдельных биосенсорных лунок. По возможности используйте три технических повтора. Вернуть обработанные клетки в инкубатор на 24-48 ч. Инкубировать в тех же условиях, которые описаны в шаге 3.6.
заметка: Подходящим условием отрицательного контроля для этой установки являются биосенсорные клетки, обработанные пустыми липосомами (т.е. липосомный реагент + восстановленная сывороточная среда), поскольку применение фосфолипидов приводит к небольшому сдвигу профиля флуоресценции по сравнению с биосенсорными клетками, не подвергавшимися воздействию липосомального реагента.
5. Сбор клеток для проточной цитометрии FRET
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед сбором клеток - обычно через 24-48 часов после обработки - можно получить предварительное считывание активности посева с помощью фильтра зеленого флуоресцентного белка (GFP) на стандартном инвертированном флуоресцентном микроскопе. Клетки, обработанные без затравочного материала (т.е. пустые липосомы), будут демонстрировать диффузную флуоресценцию, в то время как клетки, обработанные затравочным материалом, будут демонстрировать интенсивные точечные и ретикулярные внутриклеточные включения (рис. 1A-B).
- С помощью многоканального пипета аспирируйте всю клеточную среду (150 μл). Трипсинизировать (50 μл) клетки в течение 5 минут и погасить охлажденной питательной средой 150 μл. Не включайте полоскание PBS перед трипсинизацией на этом этапе, так как это может привести к лифтингу клеток и последующей потере клеток. Исключите любые загрязнения мертвых клеток и мусора во время проточной цитометрии с помощью стратегий стробирования.
- Сразу после закалки перенесите ячейки на 96-луночную круглую днопластину и центрифугируйте при давлении 1000 x g в течение 5 минут при RT.
- Отсадите и отбросьте среду, стараясь не нарушить клеточную гранулу.
- Аккуратно, но тщательно повторно суспендируйте клеточную гранулу в 50 мкл 2% параформальдегида и инкубируйте в течение 10 мин. В качестве альтернативы запускайте клетки живыми, хотя фиксация обеспечивает более чистые и стабильные результаты.
- Центрифугируйте ячейки при давлении 1000 x g в течение 5 мин. Аспиратируйте и удаляйте параформальдегид, стараясь не повредить клеточную гранулу.
- Аккуратно, но тщательно повторно суспендируйте клеточную гранулу в охлажденном буфере для проточной цитометрии объемом 200 мкл (Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS), 1% FBS, 1 mM EDTA) и запустите планшет как можно скорее, чтобы избежать слипания клеток.
6. Проточная цитометрия FRET
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте проточный цитометр, такой как MACSQuant VYB, который оснащен FRET-совместимыми лазерными линиями и наборами фильтров (Таблица 2). Для каждого шага в этом разделе щелкните интересующую скважину, используя шаблон 96 скважин программного обеспечения, и нажмите «воспроизвести», чтобы начать забор и подачу пробы. Стройте графики или таблицы статистики, нажав на иконку «Новое окно анализа». Чтобы изменить параметры оси на отдельных двумерных графиках, щелкните заголовок на оси X или Y и выберите соответствующий фильтр. Чтобы изменить популяции клеток или сигналы флуоресценции, увеличьте или уменьшите напряжение, связанное с соответствующими фильтрами. С помощью этого прибора можно выполнять <1 000 событий в секунду, чтобы обеспечить точный мониторинг отдельных клеток.
- Построите двумерный график между боковой областью рассеяния (SSC-A) и прямой областью рассеяния (FSC-A) и, выполняя линию ячеек #1, отрегулируйте напряжения SSC и FSC до тех пор, пока популяция клеток не окажется в нижнем левом квадранте. Щелкните инструмент полигон и определите население ячеек (Gate P1). Все параметры стробирования см. на рисунке 2.
- Создайте двумерный график между FSC-H (высота) и FSC-A и примените к этому графику стрит P1, щелкнув кнопку "live" над графиком и выбрав P1. Когда линия ячеек #1 выполнена, щелкните инструмент многоугольник и определите отдельные ячейки (Gate P2).
- Построим 3 гистограммы, по одному для каждого из интересующих фильтров: CFP, YFP и FRET. Примените стрильгу P2 ко всем этим графикам, нажав кнопку "live" над графиками и выбрав P2. При работающей клеточной линии #1 отрегулируйте напряжение таким образом, чтобы медиана популяции клеток на гистограммах CFP, YFP и FRET была в диапазоне от 0 до 1. Чтобы измерить CFP и FRET, возбуждайте клетки лазером с длиной волны 405 нм и захватывайте флуоресценцию с помощью фильтра 450/50 нм и 525/50 нм соответственно. Чтобы измерить YFP, возбуждайте клетки с помощью лазера с длиной волны 488 нм и захватывайте флуоресценцию с помощью фильтра с длиной волны 525/50 нм. Настройки лазера и фильтра более подробно описаны в таблице 2.
- Выполните компенсацию перетока CFP в каналы FRET и YFP.
заметка: Компенсация – это процесс коррекции перетока флуоресценции. Рассеивание флуоресценции происходит, когда флуоресцентное излучение одного флуорохрома обнаруживается в фильтре, предназначенном для измерения сигнала от другого флуорохрома. При надлежащей компенсации флуоресценция перелива CFP может быть удалена из каналов FRET и YFP.
заметка: Компенсация требует наличия как флуоресцентно-положительных, так и -отрицательных клеток. Таким образом, для компенсации CFP-положительных клеток (клеточная линия #2) отрицательные клетки (клеточная линия #1) должны быть добавлены в образец до прогона.
- Внесите 30 мкл суспензии клеточной линии #1 из одной лунки в 200 мкл суспензии клеточной линии #2 непосредственно перед компенсацией.
- Нажмите на значок «Настройки инструмента», затем на вкладку «Компенсация» и установите флажок «Матрица», чтобы открыть таблицу компенсаций.
- Создайте двумерный график FRET-A и CFP-A и примените вентиль P2, как описано в шаге 6.3. Когда клеточные линии 1+2 работают, щелкните значок «квадрант» и нарисуйте квадранты таким образом, чтобы флуоресцентные -отрицательные и -положительные популяции были разделены двумя нижними квадрантами (Гейтс LL3 и LR3 соответственно).
- Создайте таблицу статистики, отображающую медианную интенсивность флуоресценции (MFI) FRET для вентилей LL3 и LR3. Корректируйте параметр FRET в матрице компенсации до тех пор, пока MFI сигнала FRET не станет эквивалентным между LL3 и LR3. После этого MFI сигнала FRET равен между неокрашенными клетками и CFP-положительными клетками, что свидетельствует об отсутствии распространения CFP в канал FRET.
- Построите двумерный график YFP-A и CFP-A и примените вентиль P2, как описано в шаге 6.3. Нарисуйте квадранты (LL4 и LR4) аналогично тому, что сделано на шаге 6.4.3.
- Создайте таблицу статистики, отображающую MFI YFP для LL4 и LR4. Корректируйте параметр YFP в матрице компенсации до тех пор, пока MFI сигнала YFP не станет эквивалентным между LL4 и LR4. На этом этапе MFI сигнала YFP равен между неокрашенными клетками и CFP-положительными клетками, что свидетельствует об отсутствии распространения CFP в канал YFP.
- После настройки строба и компенсации выделите интересующие скважины и выполните оставшуюся часть пластины.
- После того, как все примеры будут запущены, экспортируйте файлы данных, нажав «файл», затем «копировать». Перейдите на вкладку "Файлы данных", выберите папку эксперимента и нажмите кнопку "Копировать".
