Методика оценки ингибирующего влияния воздействия токсинов на миниатюрные возбуждающие постсинаптические токи (мЭПСК)

Аннотация

Источник: Hubbard, K. et. al., Функциональная оценка биологических нейротоксинов в сетевых культурах нейронов центральной нервной системы, полученных из стволовых клеток. J. vis. exp. (2015)

В видеоролике показан электрофизиологический анализ нейронов, полученных из эмбриональных стволовых клеток после воздействия нейротоксинов. Обработка этих нейронов ботулотоксинами снижает частоту спонтанных миниатюрных возбуждающих постсинаптических токов, подтверждая торможение синаптической передачи.

Протокол

1. Адаптация эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) к бесклеточной суспензионной культуре фидера

1. Размораживайте ЭСК при 37 °C до тех пор, пока не останется полоска льда.
2. С помощью пипетки P1000 аккуратно перенесите 1 - 2,5 x 10⁶ диссоциированных ЭСК в чашку, не обработанную тканевой культурой, содержащую 10 мл предварительно подогретой среды ЭСК. Инкубировать в инкубаторе для культур увлажненных тканей в течение 20 часов при 37 °C и 5% углекислом газе (CO₂).
3. Через 20 часов промойте клетки, аккуратно перенеся культуру суспензии в коническую пробирку объемом 15 мл с помощью серологической пипетки объемом 10 мл. Гранулы ESC в течение 3 мин при 200 х г. Во время отжима добавьте 10 мл свежей формы ESC со средней и низкой адгезией.
4. Аспирируйте надосадочную жидкость, стараясь не допустить смещения клеточной гранулы, и добавьте 1 мл свежей среды ESC к клеточной грануле. Перенесите клетки в бактериальную чашку с помощью пипетки P1000 и вернитесь в инкубатор.
5. Наблюдайте за клетками ежедневно до тех пор, пока агрегаты не станут видны невооруженным глазом (обычно 4 - 8 дней (d); агрегаты будут составлять 0,2 - 0,5 мм). Если агрегаты не видны через 4 дня, повторите шаг 1.3. После того как агрегаты станут видимыми, диссоциируйте и поддерживайте ESC, как описано в разделе 2.

2. Прохождение и обслуживание ESC

1. Перенесите агрегаты ESC в коническую пробирку объемом 15 мл с помощью стерильной пипетки объемом 10 мл и дайте заполнителям осесть в компактную гранулу (обычно 3–5 минут). Аспирируйте надосадочную жидкость, стараясь не нарушить клеточную гранулу, и промойте агрегаты 5 мл фосфатно-солевого буфера (PBS). Несмотря на то, что рекомендуется гравитационное осаждение, в качестве альтернативы используйте грануляторы при давлении 100 x g в течение 2,5 минут, чтобы сэкономить время.
2. Асасируйте PBS и добавьте 500 мкл трипсина. Инкубируйте агрегаты в трипсине в течение 3 мин на водяной бане при 37 °C. Добавьте 500 мкл ESC среды, чтобы разбавить трипсин, и осторожно разрастите 10 раз с помощью пипетки P1000 для разрушения агрегатов. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра.
3. Гранулы диссоциируют клетки в течение 3 мин при 200 х г и ресуспендируют клетки до конечной концентрации 1,0 х^{10 7} клеток/мл в среде ЭСК. Перенесите 150 μл (1,5 x 10⁶ клеток) в 10 мл свежей среды ESC в бактериальную чашку диаметром 10 см и верните в инкубатор для культур тканей на 48 часов. Избыток ЭСК может быть дифференцирован, криоконсервирован в концентрации 1 - 5 x 10⁶ клеток/мл в 90% среде ЭСК с добавлением 10% диметилсульфоксида (ДМСО) или отброшен.
4. Проход агрегатов каждые 48 часов. Будут хорошо видны готовые к проходу заполнители, диаметр которых превышает 0,5 мм.
   заметка: Размораживание и культивирование криоконсервированных, адаптированных к суспензии клеток осуществляется на этапах 1.2 - 1.4. Агрегаты будут готовы к отгрузке в течение 48 - 72 часов.

3. Дифференцировка нейронов

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните шаги 3.1 - 3.5 до полудня и шаг 3.7 после полудня. Обзор процедур дифференцировки представлен на рисунке 1А.

1. Диссоциируйте ESC, как показано в шагах 2.1 - 2.5. Перенесите 350 μл (3,5 x 10⁶) диссоциированных ЭСК в чашку с низким уровнем прикрепления 10 см, содержащую 25 мл дифференцировочной среды. Поместите в орбитальный шейкер с частотой вращения 30 - 45 об/мин в инкубаторе для тканевых культур при температуре 37 °C с 5%_CO2. Это первый день дифференцировки, называемый днем in vitro (DIV) -8,< бр/> заметка: Использование чашки со сверхнизкой присадкой увеличивает стоимость метода, но дает несколько больший выход, чем бактериальные чашки Петри, поскольку заполнители могут иногда прилипать к чашкам Петри. Средние объемы и количество ячеек могут быть масштабированы соответствующим образом, если предпочтительны разные размеры тарелки.
2. Через 48 часов (DIV -6) с помощью пипетки объемом 25 мл переведите дифференцирующие клеточные агрегаты в коническую пробирку объемом 50 мл. Сразу же добавьте в чашку Петри свежие 25 мл дифференцировочной среды.
3. Дайте заполнителям осесть в течение 2 - 5 минут, образуя видимую гранулу глубиной 1 - 2 мм. Игнорируйте отдельные клетки или небольшие агрегаты, оставшиеся во взвешенном состоянии. Осторожно отсадите среду и перенесите клеточную гранулу обратно в чашку Петри с помощью P1000. Поместите на ротационный шейкер в инкубатор для культуры тканей.
4. В DIV -4 повторите шаг 3.2. Гранула будет иметь глубину 2 - 4 мм. Замените 30 мл дифференцировочной среды с добавлением 6 мкМ полностью транс-ретиноевой кислоты (РА) в чашку Петри. Вернитесь к ротационному встряхивателю в инкубаторе для культивирования тканей еще на 48 часов.
5. В DIV -2 повторите шаг 3.3. На этом этапе гранула будет иметь глубину 4 - 8 мм.
6. В DIV -1 подготовьте поверхности для гальванического покрытия, как указано в разделе 4.
7. При DIV 0 разморозить 5 мл предварительно аликвотированной и замороженной среды трипсинизации нейральных клеток-предшественников (NPC) при 37 °C в течение 5 - 10 мин и поместить в колпак для культуры тканей. С помощью пипетки объемом 25 мл перенесите дифференцирующие агрегаты в коническую пробирку объемом 50 мл. Дайте заполнителям осесть и осторожно аспирируйте среду. Промойте гранулу дважды 10 мл PBS, дав заполнителям осесть между промывками.
8. После второй промывки PBS добавьте в гранулу 5 мл среды для трипсинизации NPC и выдерживайте при 37 °C в течение 5 мин. Осторожно переверните пробирку через 2,5 мин.
9. Добавьте 5 мл 0,1% ингибитора трипсина сои (ИППП) для инактивации трипсина и перемешайте путем инвертирования. Осторожно растирайте 10–15 раз серологической пипеткой объемом 10 мл до получения относительно однородной клеточной суспензии.
10. Медленно перенесите клеточную суспензию в клеточный фильтр размером 40 мкм или 70 мкм, помещенный на верхнюю часть конической пробирки объемом 50 мл. После того, как вся суспензия будет отфильтрована, добавьте 1 мл среды N2, чтобы промыть оставшиеся клетки через фильтр, и гранулируйте диссоциированную клеточную суспензию в течение 6 минут при 200 х г.
11. Отсаживайте среду, не нарушая гранулы. Промойте ячейки дважды 10 мл среды N2, гранулированные ячейки в течение 5 минут при 200 x g и растирайте между промывками с помощью P1000. Перед вторым промывкой подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра.
12. Ресуспензируйте клетки в среде N2 со скоростью 1 x 10⁷ клеток/мл и пластинчатые нейроны, полученные из эмбриональных стволовых клеток (ESN) с плотностью клеток 150 000 - 200 000 клеток/^см2.
13. Перенесите только что покрытые ЭСН в инкубатор для увлажненных культур тканей при температуре 37 °C и 5%_CO2 и храните, как описано в разделе 5.

4. Подготовка поверхностей культуры для нанесения нейронных предшественников на DIV 0

1. Готовьте блюда, обработанные тканевыми культурами, не менее чем за 1 день до сервировки. Добавьте достаточное количество полиэтиленимина (PEI; 25 мкг/мл в стерильном H₂O) или поли-D-лизина (PDL; 100 мкг/мл в стерильном H₂O) для покрытия пластиковой посуды, обработанной культурой тканей, и инкубируйте O/N при 37 °C.
2. Утром в день сервировки вымойте посуду дважды с помощью дважды дистиллированного H₂O и один раз с PBS. После окончательного мытья добавьте достаточное количество N2 среды, чтобы покрыть посуду (например, 1 мл на лунку 12-луночной посуды или 4 мл на 6-сантиметровую посуду).
3. Подготовьте стеклянные покровные стекла толщиной 18 мм не менее чем за сутки до нанесения нейронного покрытия. Очистите покровные стекла плазменной очисткой в течение 4 минут.
4. Немедленно переложите очищенные покровные листы на промытую этанолом парапленку на дно большой стерильной посуды и добавьте 400 μл раствора PEI или PDL, приготовленного как в шаге 4.1. Инкубировать в течение ночи (O/N) при 37 °C в инкубаторе для культуры тканей.
5. Утром промойте покровные стекла три раза водой и добавьте 5 мкг/мл ламинина в PBS на 1 - 3 часа при 37 °C. Перед диссоциацией нейронов аспирируйте ламинин и немедленно перенесите покровный лист в лунку 12-луночной чашки, содержащей 1 мл среды NPC, стараясь держать обработанную сторону вверх.
6. Храните посуду и покровные стекла при температуре 37 °C, пока NPC не будут готовы к подаче на тарелку.

5. Обслуживание нейронов

1. В DIV 1 аспирируйте среду и замените ее питательной средой N2.
2. В разделах 2 и 4 аспирируйте среду и замените питательной средой B27.
3. В DIV 8 аспирируйте среду и замените ее культуральной средой B27, содержащей ингибиторы митоза, для устранения загрязняющих ненейрональных клеток.
4. В DIV 12 замените на культуральную среду B27.
5. Не удаляйте DIV 12⁺ ESN из 5%_CO2 до тех пор, пока они не будут готовы.

6. Измеренное ингибирование синаптической передачи (MIST) для количественной оценки миниатюрных возбуждающих постсинаптических токов

ВНИМАНИЕ: Клостридиальные нейротоксины являются наиболее ядовитыми веществами из известных, с предполагаемыми значениями LD₅₀ для человека всего 0,1 - 1 нг/кг. Получите необходимые разрешения перед использованием этих токсинов и примите соответствующие меры предосторожности.

1. Тщательно разбавьте BoNT/A до 100x, желаемой конечной концентрации в питательной среде ESN, и нагрейте до 37 ºC. Добавьте соответствующий объем токсина в культуры DIV 21+ ESN, перемешайте чашку для культивирования и верните в инкубатор.
2. Если клетки будут проанализированы более чем через 4 часа после интоксикации, добавьте токсин в чашку и взболтайте без удаления от 5%_СО2, например, непосредственно в инкубаторе или в постоянной камере_СО2.
3. В подходящий момент времени аспирируйте питательную среду ESN и дважды промойте его внеклеточным записывающим буфером (ERB). Добавьте 4 мл ЭРБ с добавлением 5,0 мкМ тетродотоксина и 10 мкМ бикукуллина, блокирующих потенциалы действия и антагонизирующих активность рецептора ГАМК_А соответственно.
4. Перенесите чашку в электрофизиологическую установку. Для анализа тумана не требуется ни перфузия, ни контроль температуры.
5. Вытяните боросиликатное стекло с помощью съемника микропипетки, чтобы получить записывающую пипетку с сопротивлением 5-10 мОм и заполните ее внутриклеточным записывающим буфером. Перед записью аккуратно окуните наполненную записывающую пипетку в силиконизирующий реагент.
6. С помощью наполненного воздухом шприца обеспечьте положительное давление, когда записывающая пипетка опускается в ERB. После осторожного приземления записывающей пипетки на сому нейрона, которую нужно записывать, снимите положительное давление и сформируйте гигауплотнение. Уменьшите напряжение удержания до -70 мВ. Осторожно приложите отрицательное давление, чтобы разбить цельную ячеистую конфигурацию.
7. Переключитесь на токовый зажим для контроля и записи потенциала мембраны в состоянии покоя. Без поправки на потенциалы перехода жидкости потенциал мембраны покоя будет находиться в диапазоне от -67 до -82 мВ.
8. Выполните непрерывную запись клещей напряжения -70 мВ в течение 4–5 минут для обнаружения миниатюрных возбуждающих постсинаптических токов (mEPSC).
9. Анализ 4 минут записанных данных для обнаружения mEPSC с помощью программного обеспечения для обнаружения спайков со следующими настройками: Порог, 5; Период для поиска локального максимума, 10 000 μсек; Время до пика для базового уровня, 5 000 μсек; Период поиска времени затухания, 20 000 μсек; Доля пика для нахождения времени затухания, 0.37; Период для усреднения базового уровня, 1 000 μсек; Порог площади, 20; Количество баллов к среднему пику, 1; Направление пика, отрицательное.
10. Собирайте и сохраняйте информацию об обнаруженных событиях. Разделите количество обнаруженных событий за 4 минуты на 240, чтобы определить частоту mEPSC в Гц.
11. Соберите частоты mEPSC для 8 - 12 контрольных элементов и 8 - 12 образцов, обработанных BoNT, для каждого условия воздействия. Анализируйте частоту в сравнении с контрольной группой, соответствующей возрасту и партии. Определите статистическую значимость % ингибирования синаптической активности с помощью одностороннего ANOVA и апостериорного теста Даннетта.

Результаты

Рисунок 1. Адаптированные к суспензии ЭСН остаются митотически стабильными и экспрессируют маркеры плюрипотентности. (A) Схема обслуживания и дифференциации ESC. Наличие или отсутствие ретиноевой кислоты (РА) или фактора, ингибирующего лейкоз (ЛИФ), обозначается знаком + или –. Приведено сравнение между днями in vitro (DIV) и классическими стадиями развития (DS) для первичн...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Таблица 1. ESC и ESN
Нокаут DMEM	Технологии жизни	10829-018	Среда: культуральная среда ESC
			Формулировка и примечания: 500 мл
100x MEM NEAA	Технологии жизни	11140-050	Среда: хранить при температуре 4 °C до 1 месяца
			Формулировка и примечания: 6 мл
200 мМ L-аланил-L-глутамин	АТСС	30-2115	6 мл
Квалификация FBS	Прикладные стволовые клетки	АСМ-5007	90 мл
100 антибиотиков	Сигма-Олдрич	А5955	3 мл
55 мМ 2-меркаптоэтанол	Технологии жизни	21985-023	1,1 мл
107 единиц/мл LIF	Millipore	ESG1107	60 μL
Нокаут DMEM	Технологии жизни	10829-018	Среда: среда дифференциации ESC
			Формулировка и примечания: 436,6 мл
100x MEM NEAA	Технологии жизни	11140-050	Среда: хранить при температуре 4 °C до 1 месяца
			Формулировка и примечания: 5 мл
200 мМ L-аланил-L-глутамин	АТСС	30-2115	5 мл
Сыворотка, сертифицированная ESC	Прикладные стволовые клетки	АСМ-5007	50 мл
100 антибиотиков	Сигма-Олдрич	А5955	2,5 мл
55 мМ 2-меркаптоэтанол	Технологии жизни	21985-023	0,9 мл
PBS Дульбекко	Сигма-Олдрич	D8537	Носитель: Среда трипсинизации NPC
			Формулировка и примечания: 100 мл
0,5 млн ЭДТА (18,3%)	Сигма-Олдрич	3690	Носитель: заморозьте в 5 мл алиquote
			Формулировка и примечания: 0,266 мл
Трипсин	Сигма-Олдрич	Т8802	50 мг
Полиэтиленимин (PEI)	Сигма-Олдрич	П3143	Носители: Решения для нанесения поверхностных покрытий
			Формулировка и примечания: 2,5 мкг/мл в H20
Поли-D-лизин (PDL)	Сигма-Олдрич	П7280	Носитель: использование в течение 1 недели
			Формулировка и примечания: 100 мкг/мл в H20
Ламинин	Сигма-Олдрич	L2020	5 μг/мл в H20
DMEM/F12 + GlutaMAX	Технологии жизни	10565-018	Носитель: среда культуры NPC
			Формулировка и примечания: 492,5 мл
100x N2 витаминов	Технологии жизни	17502-048	Среда: хранить при температуре 4 °C до 1 месяца
			Формулировка и примечания: 5 мл
100 антибиотиков	Сигма-Олдрич	А5955	2,5 мл
Нейробазальный А	Технологии жизни	10888-022	Среда: культуральная среда ESN
			Формулировка и примечания: 482,5 мл
50x витамины B27	Технологии жизни	17504-044	Среда: хранить при температуре 4 °C до 1 месяца
			Формулировка и примечания: 10 мл
200 мМ L-аланил-L-глутамин	АТСС	30-2115	5 мл
100x антибиотиков	Сигма-Олдрич	А5955	2,5 мл
5-фтор-2'-дезоксиуридин (5FDU)	Сигма-Олдрич	F0503	Среда: 2000x Митотические ингибиторы аликвоты и хранить при -20 °C
			Состав и примечания: дд 150 мг 5FDU и 350 мг уридина до 10 мл нейробазала А. Стерильный фильтр, аликвот и заморозка. Используйте 2000x в питательной среде ESN.
Uridine	Сигма-Олдрич	U3003
TrypLE Express Trypsin	Технологии жизни	12605-010	Медиа: Разное
			Рецептура и примечания: хранить в RT
ДМСО	Сигма-Олдрич	D8418	в магазине RT
Ингибитор трипсина сои (ИППП)	Сигма-Олдрич	Т6414	хранить при -20 °C
Этанол	Сигма-Олдрич	Е7023	в RT
Аскорбиновая кислота	Сигма-Олдрич	А4403	Приготовьте 100 мМ бульона, растворив 100 мг аскорбиновой кислоты в 5,7 мл смеси ДМСО/этанол 50:50.
Ретиноевая кислота (РА)	Сигма-Олдрич	Р2625	Ресуспендируйте 15 мг РА в 9 мл 50:50 ДМСО/этанол. Добавьте 1 мл 100 мл аскорбиновой кислоты. Аликвот и хранить при -80 °C. Стабильно в течение 6 месяцев
Таблица 2. МИСТ
NaCl	Сигма-Олдрич	71386	Носитель: Внеклеточный буфер записи
			Конечная концентрация (мМ): 58,44
			МВт: 140
KCl	Сигма-Олдрич	60135	Среда: (ERB; pH = 7,3, 315 мО)
			Конечная концентрация (мМ): 74,56
			МВт: 3,5
NaH2PO4	Сигма-Олдрич	С3139	Среда: Стабильно при 4 °C в течение не менее 6 месяцев
			Конечная концентрация (мМ): 119,98
			МВт: 1,25
CaCl2	Сигма-Олдрич	21115	Конечная концентрация (мМ): 110,98
			МВт: 2
MgCl2	Сигма-Олдрич	63069	Конечная концентрация (мМ): 95,21
			МВ: 1
D-глюкоза	Сигма-Олдрич	G8644	Конечная концентрация (мМ): 180,16
			МВт: 10
ХЕПЕС	Сигма-Олдрич	H0887	Конечная концентрация (мМ): 238,3
			МВ: 10
K-глюконат	Сигма-Олдрич	П1847	Среда: Буфер внутриклеточной записи
			Конечная концентрация (мМ): 234,5
			МВт: 140
NaCl	Сигма-Олдрич	71386	Среда: (IRB; pH = 7,3, 320 мО)
			Конечная концентрация (мМ): 58,44
			МВ: 5
Mg-АТФ	Сигма-Олдрич	А9187	Среда: Стабильная при 4 °C в течение не менее 6 месяцев
			Конечная концентрация (мМ): 507,18
			МВ: 2
Li-GTP	Сигма-Олдрич	G5884	Конечная концентрация (мМ): 523,18
			МВт: 0,5
CaCl2	Сигма-Олдрич	21115	Среда: Стабильная при 4 °C в течение не менее 6 месяцев
			Конечная концентрация (мМ): 110,98
			МВт: 0,1
MgCl2	Сигма-Олдрич	63069	Среда: Стабильно при 4 °C в течение не менее 6 месяцев
			Конечная концентрация (мМ): 95,21
			МВ: 1
ЭГТА	Сигма-Олдрич	E3889	380.35 Среда: Стабильная при 4 °C в течение не менее 6 месяцев Конечная концентрация (мМ): 380,35 МВ: 1
ХЕПЕС	Сигма-Олдрич	H0887	Среда: Стабильная при 4 °C в течение не менее 6 месяцев
			Конечная концентрация (мМ): 238,3
			МВт: 10
Бикукуллин	Токрис	131	Медиа: Разное
			Конечная концентрация (мМ): 0,01
			МВт: 417.85
CNQX	Сигма-Олдрич	С239	Конечная концентрация (мМ): 0,01
			МВт: 276.12
Тетродотоксин	Сигма-Олдрич	А8001	Конечная концентрация (мМ): 0,005
			МВт: 645.74
BoNT/A-/G	Метабиологические препараты	Н/Д	Медиа:
			Конечная концентрация (мМ): TBD
			МВт: 150,000
Столбнячный токсин	Сигма-Олдрич	Т3194	Конечная концентрация (мМ): TBD
			МВт: 150,000
Сигмакот	Сигма-Олдрич	СЛ-2	Конечная концентрация (мм): н/д
			MW: Н/Д
Таблица 3. Оборудование и программное обеспечение
MiniAnalysis (версия 6.0.7)	Synaptosoft, Inc.	Н/Д	Программное обеспечение для обнаружения событий
Igor Pro (версия 6.22A)	Волновая метрика	Н/Д	Программное обеспечение для визуализации записей
Патчмастер	Heka	Н/Д	Программное обеспечение для сбора данных
Инвертированный микроскоп Olympus IX51	Олимп	Н/Д
Микроманипулятор	Саттер Инструмент	MPC-365
Усилитель с патч-клэмпом	Хека	ECB10USB
Съемник микропипетки	Инструмент Саттера	П-1000
Боросиликатные капиллярные трубки	Инструмент Саттера	Б150-86-10	Corning 7740
Стеклянные покровные стекла 18 мм	Фишер	12-545-84
Плазменный очиститель	Гаррик Плазма	PDC-32G
Сетчатый фильтр (40 мкм)	Фишер	08-771-1
Стовалл Шейкер Танцовщицы Живота	Фишер	15-453-211
Тарелки с низкой адгезией	Фишер	05-539-101	Corning 3262
Бактериальные блюда	VWR	25384-302	100 x 15 мм