Получение и очистка рекомбинантных антител из клеток млекопитающих

Аннотация

Источник: Shivange, Gururaj, et al. Анализ распределения опухоли и тканей целевого антиген-специфического терапевтического антитела. J. Vis. Exp.(2020).

Видео объясняет процесс производства антител в клетках хозяина млекопитающих, от экспрессии генов до секреции. Он включает в себя транскрипцию, трансляцию, распознавание сигналов, правильное сворачивание и, в конечном итоге, высвобождение во внеклеточную среду через секреторные везикулы.

Протокол

1. Экспрессия и очистка антител

1. Обслуживание ячеек CHO
   1. Выращивайте клетки CHO в среде FreeStyle CHO с коммерчески доступной добавкой 1x глутамина при 37 °C, встряхивая при 130 об/мин с 5%_CO2, используя колбы Эрленмейера delong, стеклянных или одноразовых.
      заметка: Настоятельно рекомендуется использовать колбу с перегородкой и вентилируемой крышкой для повышения перемешивания и улучшения газопередачи в условиях встряхивания. Значительно сниженный выход антител был получен при использовании обычных колб (без перегородки) из-за ограниченного перемешивания культуры суспензии.
   2. Поддерживайте количество клеток в диапазоне 1-5 x 10⁶ клеток/мл с жизнеспособностью клеток >95%. Если количество клеток увеличивается более чем в 5 x 10^{до 6} клеток/мл, разделите ячейки. Никогда не допускайте, чтобы уровень клеток CHO опускался ниже 0,2 x 10⁶ клеток/мл.
2. Трансфекция клеток CHO
   1. Выращивайте клетки CHO в 200 мл среды (2 x 10⁶ клеток/мл) в колбах с перегородкой Эрленмейера.
      заметка: Суспензионные культуры, выращенные в перегородчатых колбах, всегда давали более высокий выход белка по сравнению с выращиванием в неперегородчатых колбах.
   2. В пробирку объемом 15 мл возьмите 5 мл среды CHO FreeStyle и добавьте 50 г клонированной ДНК VH и 75 г клонированной ДНК VL. Вихрь хорошо перемешать.
   3. Инкубировать смесь ДНК при комнатной температуре в течение 5 мин.<бр/> заметка: Более длительная инкубация снижает выход белка.
   4. Добавьте 750 μл 1 мг/мл полиэтиленимина (PEI) в раствор ДНК и агрессивно перебивайте смесь в течение 30 с. Инкубируйте при комнатной температуре еще 5 мин.<бр/> заметка: ПЭИ должен быть свежим. Многократный цикл замораживания и оттаивания PEI значительно снижает общую производительность.
   5. Добавьте всю смесь ДНК и ПЭИ к клеткам, вручную встряхивая колбу. Немедленно инкубируйте в перегородке Делонга колбы с ячейками при 37 °С, встряхивая при 130 об/мин.
3. Выражение
   ПРИМЕЧАНИЕ: Антитело имеет секреторный сигнальный пептид, сконструированный к его N-концевому концу, который помогает антителам выделяться в среду.
   1. Выращивайте трансфицированные клетки при температуре 37 °C, встряхивая при 130 об/мин в 1-й день.
   2. На 2-й день добавьте 2 мл 100-кратного антикомкующегося агента и 2 мл 100-кратного антибактериально-антимикотического раствора. Установите колбу на более низкую температуру (32-34 °C), встряхивая со скоростью 130 об/мин.
   3. Каждый пятый день добавляйте 10 мл корма Tryptone N1 и 2 мл 100-кратной добавки глутамина.
   4. Продолжайте подсчет клеток каждый третий день с помощью гемоцитометра после окрашивания аликвоты клеток трипановым синим красителем. Следите за тем, чтобы жизнеспособность клеток оставалась выше 80%.
   5. На 10 или 11 день соберите среду для очистки антител. Открутите культуру при температуре 3000 x g, 4 °C в течение 40-60 минут, а затем отфильтруйте прозрачную среду с помощью бутылочных фильтров 0,22 μM.
4. Очищение
   заметка: Очистку антител проводят с помощью коммерчески доступной колонки Protein-A (см. Таблицу материалов) с помощью перистальтического насоса.
   1. Уравновесьте колонку двухколоночным объемом связующего буфера (20 мМ фосфата натрия при pH 7,4).
   2. Пропустите отфильтрованную среду, содержащую антитела (полученную на шаге 1.3.5), через колонку со скоростью потока 1 мл/мин.
   3. Промойте колонку двухколоночным объемом связующего буфера.
   4. Разбавьте антитело на фракции по 500 мкл, используя элюирующий буфер объемом 5 мл (30 мМ ацетата натрия при pH 3,4).
   5. Нейтрализуйте рН элюированного антитела путем добавления 10 мкл нейтрализующего буфера (3 М ацетата натрия при рН 9) на фракцию.<бр/> заметка: Фракции под номерами 3-6 содержат большую часть антител. Желательно сохранить все фракции на случай, если антитело будет элюировано в более поздней фракции, чем ожидалось.
   6. Измерьте концентрацию очищенных антител с помощью спектрофотометра, выбрав протокол по умолчанию для IgG. Конечную концентрацию антитела получают в мг/мл с учетом молекулярной массы и коэффициента поглощения.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Носители FreeStyle CHO	Технологии Gibco Life	Кот # 12651-014
Анти-Анти (100Х)	Технологии Gibco Life	Кот # 15240-062
Антикомкующийся агент	Технологии Gibco Life	Кот # 01-0057DG
Инсулиновый шприц BD	BD BioSciences	Кот #329420
Штангенциркуль IVIS Spectrum	ПеркинЭлмер	Кот #124262
CHO CD EfficientFeed B	Технологии Gibco Life	Кот #A10240-01
Corning 500 мл DMEM (модифицированная среда Dulbecco's Eagle's Medium)	Корнинг	Кошка # 10-13-CV
Corning 500 мл RPMI 1640	Корнинг	Кот # 10-040-CV
Cy5 конъюгированный античеловеческий IgG (H+L)	Иммуноисследования Джексона	Кот # 709-175-149
ГлутаМакс-I (100Х)	Технологии Gibco Life	Кот # 35050-061
Набор HiPure Plasmid Maxiprep	Инвитроген	Кот # K21007
Колонка HiTrap MabSelect SuRe	GE Healthcare	Кот # 11-0034-93
Изофлуран, USP	Коветрус	Кот # 11695-6777-2
Мазь-лубрикант для глаз	Освежите Lacri-Lube	Кот #4089
Реагент для трансфекции ПЭИ	Термо Фишер	Кошка # BMS1003A
Экспериментальные модели: клеточные линии
Человек: OVCAR-3	Коллекция американской типовой культуры	АТКС HTB-161
Человек: клетки CHO-K	Стабильная трансформация в нашей лаборатории	ATCC CCL-61
Мышь: 4T1	Добрый подарок от доктора Чипа Ландена, UVA
Мышь: MC38	Добрый подарок от доктора Сюзанны Остранд-Розенберг, UMBC	Аутентификация с помощью профилирования STR