Измерение активации fc-опосредованных эффекторных функций антителами к ГК

Аннотация

Источник: Bailey, M. J., et al. Метод оценки fc-опосредованных эффекторных функций, индуцированных специфическими антителами к гемагглютинину гриппа. J. vis. Exp. (2018).

Это видео демонстрирует анализ, измеряющий антитело-опосредованную активацию эффекторных функций Т-клеток. Добавление моноклонального антитела, специфичного к вирусу гриппа гемагглютинина (ГА), к трансфицированным клеткам млекопитающих, экспрессирующим ГК, приводит к образованию иммунных комплексов с ГК. При введении сконструированных Т-клеток, экспрессирующих Fc-рецепторы и люциферазный репортер, Т-клетки активируются комплексами антитело-HA, и эта активация обнаруживается путем добавления субстрата люциферазы и измерения полученной биолюминесценции.

Протокол

1. Экспрессия гемагглютинина вируса гриппа при трансфекции

1. Пластинчатые клетки эмбриональной почки человека (HEK 293T) плотностью 2 x 10 4 клетки/лунку в культуре белых тканей обрабатывают 96-луночным планшетом и оставляют в течение 4 часов в инкубаторе при температуре 37 °C (с 5%_CO2).
2. Трансфектировать клетки с 100 нг ДНК, кодирующей вирусный гемагглютинин и 0,2 мкл реагента для трансфекции на лунку в общем объеме 50 мкл<бр/> заметка: Как плазмидный, так и трансфектантный реагент разбавлены в 1x Opti-Minimum Essential Media (MEM) Reduced Serum Medium.
3. После инкубации планшетов в инкубаторе при температуре 37 °C с 5%_CO2 в течение 18 ч удалите трансфекционные среды.

2. Оценка FcRg/NFAT-опосредованной активации активности люциферазы моноклональными антителами или сыворотками

1. Во-первых, замените питательную среду трансфицированных клеток 25 μл пробирной среды (1x RPMI 1640 с добавлением 4% (об/об) сыворотки плода крупного рогатого скота с низким содержанием IgG).
2. В отдельном 96-луночном планшете выполните четырехкратное разведение представляющих интерес антител, начиная с 30 мкг/мл, с использованием среды для анализа. Выполняйте разведение в трех экземплярах, пример компоновки пластин показан на рисунке 1A. Убедитесь, что включен контроль, исключающий антитела (без контроля антител) и фоновый контроль (только буфер для анализа).
   заметка: Как для контроля «без антител», так и для фонового контроля добавьте 25 мкл буфера для анализа вместо антител.
3. Перенесите 25 мкл последовательно разведенных антител с Шага 2.2 в соответствующие лунки на планшете трансфицированных клеток.
4. Инкубируйте в инкубаторе при температуре 37 °C (с 5%_CO2) в течение 15 минут.
5. Добавьте 25 мкл соответствующей модифицированной эффекторной клетки Jurkat, экспрессирующей мышиный FcgRIV или человеческий FcgRIIIa (75 000 клеток/лунку). Общий объем для каждой лунки должен составлять 75 мкл, а начальная конечная концентрация антитела находится на уровне 10 мкг/мл (рис. 1В).
   заметка: Для фонового контроля добавьте 25 мкл буфера для анализа вместо эффекторных ячеек. Для изучения антителозависимого клеточно-опосредованного фагоцитоза можно использовать модифицированную клетку Jurkat, экспрессирующую FcgRIIa человека.
6. Инкубируйте планшет в инкубаторе при температуре 37 °C с 5%_CO2 в течение 6 часов.
7. Разморозьте и согрейте субстрат люциферазы в воде при температуре 37 °C в течение примерно 1 часа перед использованием.
   заметка: Чтобы получить буфер для люциферазного субстрата, восстановите лиофилизированный субстрат для анализа люциферазы в предоставленном буфере для анализа. Восстановленный буфер подложки можно хранить при температуре от -30 °C до -10 °C до шести недель.
8. Добавьте 75 μл/лунку буфера субстрата люциферазы во все лунки, кроме фонового контроля.
9. Показания на люминометре.
10. Рассчитайте индукцию сворачивания с помощью следующего уравнения: Индукция сворачивания = (Индуцированное значение-Фоновое значение) / (Без значения мАб-Фоновое значение).

Результаты

Рисунок 1: Схема расположения образца пластины и состава экспериментальных групп. (А) Начальная концентрация для каждого образца антитела составляет 10 г/мл и последовательно разбавляется по всей пластине (столбец 1 - столбец 12) в 4 раза. Каждый образец делается в трех экземплярах. Строка G зарезервирована для элемента управления без mAb, а строка H является фоном. (B

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Элементы HEK 293T	АТКС	КРЛ-3216	Эмбриональные клетки почек человека
Липофектамин 2000	Технологии Life	11668019	Реагент для трансфекции
1X Opti-MEM Уменьшенная сыворотка Medium	ThermoFisher Scientific	51985-034
Культура белых тканей обработана 96-луночным планшетом	Компания Corning, Inc.	No 3917	Пробирные пластины
10X МЭМ	Gibco	11430-030
Клетка Jurkat, экспрессирующая мышиный FcgRIV	Компания Promega	М1201	В комплект входят клетки, система анализа Bio-Glo Luciferase, 1X RPMI и сыворотка с низким уровнем IgG
Клетка Jurkat, экспрессирующая человеческий FcgRIIIa	Компания Promega	Г7010	В комплект входят клетки, система анализа Bio-Glo Luciferase, 1X RPMI и сыворотка с низким уровнем IgG
Клетка Jurkat, экспрессирующая FcgRIIa человека	Компания Promega	Г9901	В комплект входят клетки, система анализа Bio-Glo Luciferase, 1X RPMI и сыворотка с низким уровнем IgG
Люминометр	БиоТек	Многорежимный считыватель Synergy H1	Считыватель люминесцентных пластин
Система анализа Bio-Glo люциферазы	Компания Promega	Г7940	Содержит буфер для анализа люциферазы и субстрат для анализа люциферазы