ПРИМЕЧАНИЕ: ГК-специфические антитела, которые ингибируют репликацию вируса, обычно можно разделить на i) те, которые связываются на или рядом с рецепторным связывающим сайтом на верхней части глобулярной головки, и ii) те, которые связываются дистальнее рецептор-связывающего домена, который включает латеральную сторону глобулярной головки и область стебля ГК. Антитела, нацеленные на сайт связывания рецептора, предотвращают вовлечение мотивов сиаловой кислоты на поверхности клеток-мишеней и могут быть измерены с помощью анализа ингибирования гемагглютинации (HI). Антитела, которые являются HI-отрицательными, такие как стеблевые антитела, все еще могут ингибировать репликацию вируса, но могут быть оценены только с помощью анализов нейтрализации.
1. Категоризация антител на основе активности HI
- Анализ HI
- В 96-луночный планшет с V-образным дном добавьте 25 μL 1x PBS в столбцы со 2 по 12.
- Разбавляют моноклональное антитело (mAb) 7B2 (головоспецифичное), 6F12 (стебель-специфичное) и контроль изотипа до 100 мкг/мл в 1x PBS и аликвоту 50 мкл разведенных препаратов антител в колонке 1. Кроме того, включите контроль без mAb, добавив 50 мкл 1x фосфатно-солевого буфера (PBS) (рис. 1A).
- Проводят 2-кратное серийное разведение антител путем переноса 25 мкл из колонки 1 в колонку 2 и т.д. Выбросьте последние 25 μL из колонки 12 (рис. 1A).
заметка: Обязательно включите строку «Контроль отсутствия антител».
- Разбавьте вирусный запас (реассортантный вирус, экспрессирующий гемагглютинин (HA) и нейраминидазу (NA) из A/California/04/09 с внутренними сегментами A/Puerto Rico/8/34) до 8 гемагглютинирующих единиц/25 мкл разведенного вирусного запаса. Добавьте 25 мкл разведенного вирусного запаса (8 гемагглютинации) в каждую лунку (строки от A до G).
заметка: Смесь антител и вируса должна иметь конечный объем 50 мкл с начальной конечной концентрацией 50 мкг/мл.
- Инкубируйте планшет при комнатной температуре (RT) в течение 45 минут.
- Для строки обратного титрования (H) добавьте 50 μL 1x PBS в лунки от H2 до H12. Добавьте 100 μL из 8 единиц гемагглютинации/25 μL в лунку H1. Последовательно разбавляйте в два раза, переводя 50 мкл из H1 в H2 и так далее. Выбросьте последние 50 мкл из лунки H12. Наконец, добавьте 50 мкл 0,5% куриных эритроцитов (эритроцитов) во все лунки 96-луночного V-образного дна.
заметка: Образцы mAb в анализе должны иметь конечный объем 100 μL: mAb (25 μL), вирус (25 μL) и эритроциты (50 μL). Конечный объем контроля no mAb должен содержать 25 мкл 1x PBS, 25 мкл вируса и 50 мкл эритроцитов.
- Инкубируйте планшет при температуре 4 °C в течение 1 ч.
- Визуально считайте таблички на предмет активности HI. Если показания по определенному антителу положительные, перейдите к шагу 2.1 для создания вариантов escape-выхода. Если антитело является HI-отрицательным, перейдите ниже к шагу 1.2, чтобы оценить, обладает ли антитело нейтрализующей активностью в анализе клеточной культуры.
заметка: На положительный результат HI-активного mAb указывает темно-красная гранула эритроцита в центре лунки (рис. 1B; 7B2), которая образует слезную каплю при удержании 96-луночной V-образной нижней пластины под углом 45°. Отрицательное показание не приведет к образованию темно-красной гранулы эритроцитов в скважине (рисунок 1B; 6F12 и отсутствие mAb). Контрольный изотип также не образует темно-красную гранулу эритроцитов и должен выглядеть идентично стебель-специфическому антителу 6F12 или контрольному образцу без mAb (рис. 1B).
2. Генерация вариантов мутантов побега
ПРИМЕЧАНИЕ: Нейтрализующие антитела, которые имеют или не обладают активностью HI, дополнительно анализируются с помощью специальных протоколов, описанных ниже.
- Протокол 1: HI-положительные/нейтрализационно-положительные антитела (Рисунок 2A)
- Приготовьте вирусный запас из 106 бляшенообразующих единиц/миллилитр (БОЕ/мл) в 1x PBS в объеме 400 μл.
- Приготовьте четыре разведения представляющего интерес антитела в возрастающих концентрациях (например, 0, 0,5, 0,05 и 0,005 мг/мл) в 1x PBS в объеме 100 мкл на одно разведение.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вирус дикого типа всегда должен проходить параллельно и при отсутствии антител. Последовательности этих пассаженных вирусов помогут различать адаптацию к условиям клеточной культуры и ускользающие мутации.
- Смешайте 100 мкл 10 мкл 10 6 БОЕ/мл вируса со 100 мкл каждого разведения антител или 100 мкл 1x PBS.
- Инкубировать в течение 1 ч в инкубаторе при температуре 37 °C (с 5%CO2). Вихрь кратко. Введите 200 мкл каждой смеси в эмбриональные куриные яйца, не содержащие специфических патогенов (SPF).
- Инкубировать яйца при температуре 37 °C (без CO2) в течение 40-44 часов.
- Инфицированные вирусом эмбрионированные яйца должны быть уничтожены путем инкубации при температуре 4 °C в течение не менее 6 часов.
- Соберите аллантоисную жидкость из яиц, как описано ранее.
- Проведите анализ гемагглютинации, как описано выше. Если все препараты аллантоевой жидкости не имеют титров гемагглютинации, повторите шаг 2 с разведениями антител в диапазоне от 0,005 мг/мл до 0,00005 мг/мл.
заметка: Насыщающая концентрация HI-положительного антитела может нейтрализовать все присутствующие вирусные частицы. Следовательно, может потребоваться уменьшение количества антител, присутствующих при пассаже.
- Подтвердите варианты побега, выполнив анализ HI (шаг 1.1).
заметка: HI-активные антитела блокируют взаимодействие мотивов сиаловой кислоты с ГК на клетках-мишенях. Таким образом, вирус в присутствии родственного ему антитела теряет способность к агглютинации эритроцитов (присутствие гранулы эритроцитов). Теоретически, эскейп-варианты высокоактивных антител могут связываться с мотивами сиаловой кислоты даже в присутствии родственного ей антитела и, таким образом, могут агглютинировать эритроциты (без гранул эритроцитов). Если HI представляющего интерес антитела все еще обнаруживается, повторите протокол, начиная с шага 2.1.2, с более высокой начальной концентрацией антитела.
