Получение рекомбинантных моноклональных антител из клеточных культур млекопитающих

Аннотация

Источник: Nogales-Gadea, G. et al., Генерация рекомбинантных моноклональных антител IgG человека из иммортализованных сортированных B-клеток.J. Vis. Exp.(2015)

Это видео демонстрирует метод генерации антител из клеток млекопитающих путем введения плазмидных векторов с генами тяжелой и легкой цепи. Эти векторы взаимодействуют с полиэтиленимином и проникают в клетки, образуя полиплексы; Позже они транслируются в отдельные белки и собираются в полноценные антитела, которые секретируются во внеклеточную среду.

Протокол

Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.

1. Выделение мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC)

1. Центрифугируйте 25 мл гепаринизированной крови участников в дозе 900 х г в течение 15 минут, как можно скорее после забора крови. Если крови меньше, соответственно уменьшите количество реагентов. Выполняйте все следующие действия в капюшоне.
2. Переложите сыворотку в чистую пробирку. Его можно использовать на более поздних этапах для замораживания PBMC или в случае аутоиммунных пациентов для тестирования аутоантител.
3. Разбавьте кровь 10 мл среды Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 и ресуспендируйте клетки путем пипетирования вверх и вниз.
4. Добавьте 15 мл раствора, содержащего полисахарозу и диатризоат натрия (1,077 г/мл), в новую пробирку объемом 50 мл.
5. Аккуратно налейте кровь поверх раствора на шаге 1.4, приблизив два отверстия пробирок друг к другу до тех пор, пока две жидкости не начнут очень медленно соприкасаться, а затем медленно сцедите суспензию PBMC поверх пробирки объемом 50 мл. Этот шаг имеет решающее значение для обеспечения хорошего разделения PBMC.
6. Центрифугируйте пробирку, полученную на шаге 1.5, при 400 x g без тормоза при комнатной температуре (RT) в течение 20 мин.
7. После центрифугирования с помощью пипетки восстановите белое кольцо, которое появляется в средней части пробирки, содержащей PBMC.
8. Промойте ячейки 25 мл среды RPMI 1640.
9. Центрифуга 300 x g при RT в течение 10 мин.
10. Выбросьте надосадочную жидкость и промойте клетки 10 мл RPMI 1640. Снова центрифугируете, как в шаге 1.9.
11. Посчитайте PBMC с камерой Нейбауэра, как сообщалось ранее.
12. Обрабатывайте ПМК так, как описано в разделе 2, или храните их для последующего использования следующим образом: 10 миллионов ПМК для замораживания на криовиальную трубку разводят в 1 мл 10% диметилсульфоксида (ДМСО) и 90% сыворотки, полученной на этапе 1.2. Замораживайте прогрессивно и для длительного хранения в жидком азоте.

2. Окрашивание PBMCs для сортировки CD22+ и иммуноглобулина G (IgG+) методом клеточной цитометрии

1. Поместите PBMC в колбу для клеточных культур размером 25 см 2 с 6 мл полной среды RPMI 1640 (с добавлением L-глутамина, 10 мМ буфера 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазитансульфоновой кислоты (HEPES), 50 ЕД/мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина и 10% фетальной бычьей сыворотки) и дайте им восстановиться O/N в инкубаторе при 37 °C при 5% углекислом газе (CO₂).
2. Заблокируйте стерильные пробирки для сортировки клеток, активируемых флуоресценцией (FACS), стерильным 4% раствором альбуминфосфата, буферизованным солевым раствором (PBS) на ночь (O/N). Дважды промойте пробирки PBS и наполните их 500 мкл полной среды RPMI 1640. Используйте эти пробирки для восстановления клеток после сортировки.
3. Соберите PBMC в пробирку и центрифугируйте при давлении 400 x g при RT в течение 5 минут.
4. Восстановите ячейки в буфере маркировки (см. шаги 2.5 и 2.6) и подсчитайте их. Меченым буфером является стерильная 2% фетальная бычья сыворотка и 1 мМ этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) в PBS.
5. Подготовьте 3 пробирки FACS по 10⁵ ячеек в каждой и повторно суспендируйте их в 100 мкл меченого буфера. Эти трубки будут служить для определения ворот сортировки.
   1. В первую пробирку добавьте 5 мкл антитела против CD22 PerCP (рекомендуется в техническом описании производителя), во вторую пробирку 20 мкл анти-IgG PE (рекомендуется в техническом описании производителя), и ничего в третью пробирку. Инкубировать на льду и в темноте в течение 30 минут.
6. Ресуспендируйте 5 миллионов клеток в 200 мкл меченого буфера в пробирке FACS и добавьте 10 мкл анти-CD22 PerCP и 40 μл анти-IgG PE. Инкубируйте клетки на льду и в темноте в течение 30 минут. Если требуется сортировка большего количества клеток, увеличьте масштаб всех реагентов.
7. Центрифуговые ячейки при 400 x g с низким тормозом в течение 5 мин при RT.
8. Мягко сцедите надосадочную жидкость.
9. Ресуспендируйте клетки в 500 мкл меченого буфера. Центрифугируйте ячейки при 400 x g с низким тормозом в течение 5 мин при RT. Повторите шаги 2.7 и 2.8
10. Мягко сцедите надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в 300 мкл готовой среды RPMI.
11. Пропустите ячейки через фильтр 0,45 мкм. Ячейки готовы к сортировке.

3. Сортировка В-клеток CD22+ и IgG+

1. Используйте 3 контрольные трубки для установления жизнеспособности клеток. В элементе управления без окрашивания используйте прямую диаграмму рассеяния и размера для определения гейтинга лимфоцитов. Элементы управления с CD22 PerCP и анти-IgG PE служат для установки ворот и сортировочного затвора. Выполните следующие действия в соответствии с ранее сообщенными данными.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Вентиль — это набор значений пределов (границ), которые служат для выделения определенной группы цитометрических событий, в нашем случае ячеек, из большого набора. В случае сортировочного шлюза предельные значения позволяют восстановить цитометрические события, клетки, которые находятся внутри определенных границ: CD22+ и IgG+.
2. В качестве сборной пробирки при сортировке используют заблокированные пробирки с 500 мкл полной среды RPMI 1640, полученной на шаге 2.2.
3. Перейдите к сортировке с двойным положительным результатом: CD22+ IgG+. ОБРАТИТЕ ВНИМАНИЕ на итоговое количество ячеек в каждом условии. Тарелкой отсортируйте ячейки поверх подающих ячеек как можно скорее.

4. Облучение питающих клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте подготовку питающих ячеек за 1 - 3 дня до сортировки. По крайней мере, 5000 элементов wi38 требуется на одну лунку в 96-луночной пластине. Выполните шаги 4.1, 4.2 и 4.4 в капоте.

1. Культивируйте клетки wi38 при 37 °C и 5%_CO2 в полной среде RPMI 1640 (так же, как и для PBMC) до тех пор, пока не будет достигнуто желаемое количество клеток.
2. Облучайте их при температуре 50 Грей, следуя описанному ранее протоколу. Проводите облучение после трипсинизации и ресуспендирования клеток wi38 в полной среде RPMI или с помощью wi38, прикрепленного к колбе с культурой и трипсинизированного после облучения. Следуйте методу трипсинизации, указанному поставщиком элементов wi38. Облучите количество клеток, необходимое для покрытия лунок, необходимых для покрытия IgG+ В-клеток (1% от общего количества PBMC, подсчитанного на шаге 1.11).
3. Пластина 90 мкл, содержащая 5000 облученных элементов wi38 в каждой лунке из 96 круглых луночных пластин. Оставьте лунки во внешнем ряду пластины пустыми (потому что они быстрее испаряются) и используйте только 60 лунок в середине пластины для покрытия ячеек. Заполните внешние лунки, обрамляющие пластину, 200 μл PBS.
4. Поместите их в инкубатор при температуре 37 °C и 5%_CO2 до тех пор, пока они не понадобятся.

5. Гальваническое покрытие отсортированных PBMC, заражение и выращивание вируса Эпштейна-Барр (ВЭБ)

1. Разбавьте отсортированные PBMC до тарелки 50 ячеек в полной среде RPMI 1640 объемом 50 мкл на лунку в планшете с 96 круглыми лунками (предварительно покрытом облученными ячейками wi38). Выполняйте шаги в вытяжке, оборудованной для работы с EBV.
   Примечание: инфицирование 50 клеток на лунку оптимизируется и увеличивает вероятность получения моноклонального антитела, однако рекомендуется проверить это с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), как описано ранее.
2. Добавьте 60 μл надосадочной жидкости EBV (содержащей 3 - 4 x 10⁸ вирусных копий/мл) в каждую лунку в планшете с 96 круглыми лунками. Следует соблюдать осторожность во время работы с EBV.
3. Добавьте 1 мкг/мл CpG (ODN2006) на лунку.
4. Оставьте клетки в инкубаторе при температуре 37 °C при 5%_CO2.
5. Визуально наблюдайте за ростом клона под микроскопом через неделю.< /> ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые примеры роста В-клеток можно увидеть ниже в разделе результатов. Обратите внимание, что скорость роста клонов может варьироваться, и может потребоваться дополнительное время, чтобы начать наблюдать рост некоторой клеточной массы в середине лунки.
6. Через^1-ю две недели наблюдайте за выращиванием клона под световым микроскопом и приступайте к первому медиаобмену. Медленно пипетируйте 90 мкл среды из верхней части лунки и соберите в чистую 96-луночную пластину. (В-клетки находятся на дне лунки, поэтому нет риска их аспирации).
   1. Добавьте в каждую лунку 100 мкл полной среды RPMI 1640 с добавлением 1 мкг/мл CpG (ODN2006) и 50 Ед/мл IL2. Если клоны растут, проанализируйте этот первый обмен сред с помощью иммуноферментного анализа (ИФА), как показано на шаге 6.
7. Наблюдайте за клонированием и сменой среды после^3-й и^4-й недель выращивания, взяв 90 мкл среды и добавив 100 мкл полной среды RPMI 1640 с добавлением 1 мкг/мл CpG (ODN2006) и 50 Ед/мл IL2. Используйте собранный надосадочный слой для мониторинга продукции IgG методом иммуноферментного анализа, как описано в шаге 6.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Через месяц рост клона должен быть заметен при наблюдении за совокупностями круглых ячеек, которые обычно лежат в середине круглого дна колодца.
8. На этом шаге смените носитель так же, как и на предыдущих неделях, но только с полным носителем RPMI 1640. Хорошим показателем для того, чтобы узнать правильный момент для смены среды, является цвет среды, если он становится желтоватым, клетки нуждаются в обмене сред.
9. Когда 96-луночные планшеты содержат большие клоны (примерно 5 x 10⁵ клеток), перенесите их в плоскую лунку 24-луночного планшета. Добавьте в новую лунку 300 мкл полного фильтрующего материала RPMI 1640. Ресуспендируйте клон, растущий на 96 лунок, путем пипетирования вверх и вниз несколько раз, и перенесите клетки в новую лунку, равномерно распределяя. При необходимости добавляйте новые носители.
   1. Когда лунки 24-луночного планшета заполнены ячейками (примерно 5 х 10⁶ ячеек), переложите в плоскую лунку 6-луночного планшета. Добавьте в новую лунку 2 мл готового фильтрующего материала RPMI 1640. Ресуспендируйте клетки в 24-луночном планшете путем пипетирования вверх и вниз несколько раз, и равномерно распределите их в новой лунке.
10. При необходимости добавляйте медиафайлы. Если клетки не должны сохраняться в культуре, гранулируйте клетки при 400 x g в течение 5 мин в режиме ЛТ. Храните надосадочную жидкость для тестирования методом ИФА. Промойте гранулу клеток один раз 1 x PBS, снова центрифугируйте при 400 x g в течение 5 минут и храните в сухом виде при -80 °C до извлечения РНК.
    1. Когда клетки в 6-луночном планшете сливаются (примерно 20 x 10⁶ клеток), перенесите их в культуральный планшет диаметром 60 мм. Добавьте в новую пластину 4 мл готового носителя RPMI 1640. Ресуспендируйте клетки в 6-луночный планшет и перенесите их так, как это сделано в соответствии с шагами 5.9 и 5.10.
11. При необходимости добавляйте новые носители. На этом этапе замораживайте клетки в концентрации 10–30 млн/мл в 90% эмбриональной телячьей сыворотке и 10% ДМСО. Если требуется большее количество клеток, продолжайте экспансию клонов в более крупных поверхностных пластинах.

6. ИФА для обнаружения антител IgG

1. Дозируйте 50 мкл/лунку в планшете ИФА козьего F(ab)2-античеловеческого Fc-антитела, разведенного 1 200 в буфере для покрытия. Буфер покрытия содержит 50 мМ карбоната натрия (Na₂CO₃) pH 9,6.
2. Запечатайте планшеты пластиковой наклейкой и инкубируйте 1 час при 37 °C. В качестве альтернативы инкубируйте при 4 °C O/N.
3. Промойте каждую лунку 6 раз 200 μл промывочного буфера. Промывочный буфер содержит 0,05% Tween-20 в 1 x PBS. Не прикасайтесь и не царапайте поверхность лунки, где закрепилось антитело.
4. Блок с блокирующим буфером, 100 мкл/лунка. Блокирующий буфер содержит 4% обезжиренного сухого молока в PBS. Закройте планшет и выдерживайте 1 час при 37 °C.
5. Не стирайте. Выбросьте блокирующий буфер и 3 раза ударьте тарелку вверх дном по бумажному полотенцу, чтобы удалить остатки жидкости.
6. Инкубация надосадочной жидкости и стандартов клонов.
   1. Для первого испытания разбавляют супернатанты клонов, полученные на шаге 5.6 или 5.7 1/3 в RPMI. Для норм разбавить в среде RPMI раствор IgG человека получить: 1000 нг/мл, 500 нг/мл, 250 нг/мл, 125 нг/мл, 62,5 нг/мл, 31,25 нг/мл, 15,6 нг/мл и холостую. Используйте 50 μл/лунку и инкубируйте при 37 °C в течение 60 минут. Проанализируйте дальнейшие разведения надосадочной жидкости клона для проверки аффинности антител, например, 1/10 или 1/100.
7. Постирайте так, как это сделано в шаге 6.3.
8. Используйте 50 μл/лунку козьей F(ab)2 античеловеческой IgG Fc-пероксидазы, конъюгированной в соотношении 1:20 000 в инкубационном буфере. Инкубационный буфер содержит 1% бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 0,02% Tween 20 в 1x PBS. Выдерживать при 37 °C в течение 60 минут.
9. Постирайте так, как это сделано в шаге 6.3.
10. Добавьте 100 μл/луночный субстратный раствор, содержащий 0,1% 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (ТМБ). Выдерживать 10 мин до образования в лунках устойчивого синего цвета. Будь осторожен; Не ждите слишком долго!
11. Остановите реакцию, добавив 50 μл 2 М серной кислоты (H₂SO₄). Измерьте абсорбцию при длине волны 450 нм в течение 30 мин после остановки реакции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все надосадочные жидкости клонов с 3 стандартными отклонениями от бланка будут считаться положительными на антитела IgG человека. Для подтверждения положительных клонов этот ИФА следует повторить не менее трех раз в разных надосадочных зонтах одного и того же клона. Также рекомендуется исключить возможность неспецифической перекрестной реактивности, чтобы убедиться в отсутствии сигнала при инкубации надосадочной жидкости в лунках без покрытия, но заблокированных. На этом этапе можно провести детекционный анализ для скрининга антигенной специфичности представляющих интерес антител до перехода к разделу 7.

7. Выделение РНК и синтез первой цепи комплементарной ДНК (кДНК) клонов-продуцентов IgG

1. Как только выработка IgG будет подтверждена методом ИФА, извлеките РНК клона.
2. Для извлечения РНК из клеток, растущих на этапах 5.7 или 5.9, используют набор для прямого синтеза кДНК клеток Superscript III, который позволяет получать ДНК от 10 000 клеток до одной клетки.
3. Для извлечения РНК из большего количества клеток или из гранулы, хранящейся на шаге 5.11, используйте набор для выделения РНК высокой чистоты. Другие системы экстракции РНК также могут быть пригодны на этом этапе. Следуйте инструкциям производителя.
4. Для номеров ячеек от 1 x 10⁶ до 1 x 10⁴ используйте систему обратной транскрипции, следуя инструкциям производителя. Также могут быть использованы другие системы для синтеза кДНК первой цепи.

8.^1-я и^2-я ПЦР для амплификации тяжелых и легких цепей клонов IgG-продуцирующих В-клеток

1. С кДНК клеточных клонов, полученных на этапах 5.6 и 5.7 и положительных в ИФА IgG на этапе 6, проводят ПЦР с праймерами, перечисленными в таблице 1.
2. Настройте независимые ПЦР для каждой тяжелой цепи IgG, каппы и лямбда-цепи. Сделайте стоковый раствор с прямыми и обратными праймерами в равных концентрациях. Добавьте их в реакцию при конечной концентрации 0,4 μМ.
3. Используйте 1 мкл синтеза кДНК для проведения ПЦР 1^ST. Здесь выполните реакции объемом 20 мкл в соответствии с инструкциями производителя Takara Taq. В качестве альтернативы можно использовать другие полимеразы.
4. Поместите^1-ю ПЦР в следующие условия цикла: 94 °C на 5 мин; (50 циклов: 94 °C в течение 30 сек; 58 °C в течение 30 сек и 72 °C в течение 45 сек; 72 °C в течение 7 мин; дайте остыть при 4 °C. Включите в реакцию холостую часть, чтобы обнаружить возможные загрязнения.
5. Приготовьте 1x TBE (89 мМ Трис-борат и 2 мМ ЭДТА). В объем 100 мл 1х КЭ добавить 1 г агарозы (1% агарозного геля). Нагревайте раствор в микроволновой печи примерно 1 минуту, пока агароза не растворится. Затем добавьте 4 мкл 10 мг/мл бромида этидия (или эквивалентного красителя ДНК) и перемешайте.
   1. Высыпьте содержимое в лоток и подождите, пока оно полимеризуется. Внесите 5 мкл смеси ПЦР в гель, чтобы визуализировать полосы. Тяжелые фрагменты цепи должны быть около 400 - 550.о., в то время как легкая цепь должна быть около 300 - 400.о. Если полосы не обнаружены, аналогичным образом приступают ко^2-й ПЦР.
6. Используйте 1 мкл первой смеси для ПЦР для проведения^2-й ПЦР. Используйте те же реагенты, что и на шаге 8.2, но с использованием подходящей смеси грунтовок (см. таблицу 1). Для^2-й ПЦР используют следующие условия: 94 °C в течение 5 мин; (50 циклов: 94 °C в течение 30 сек; 56,5 °C в течение 30 сек и 72 °C в течение 55 сек); 72 °C в течение 7 мин; дайте ему остыть до 4 °C. Включите в реакцию холостой патрон, чтобы обнаружить возможные загрязнения ПЦР.
7. Приготовьте агарозный гель, как описано в 8.5. Запустите гель для визуализации продукта ПЦР, как показано в пункте 8.5.1 Используйте амплификаторы, которые содержат фрагменты нужного размера, для клонирования на шаге 9 и получите антитела на шаге 10.
8. Секвенировать ДНК с помощью 10 мкл реакции, содержащей: 100 нг^2-й ПЦР, 0,2 мкМ праймера или смеси праймеров, 1 мкл терминатора и 1 мкл буфера. Реакцию секвенирования проводят в следующих условиях: (25 циклов: 96 °C в течение 10 сек; 50 °C в течение 5 сек; и до 60 °C в течение 4 мин); 60 °C в течение 7 мин; дайте ему остыть до 4 °C.
9. Очистите реакции секвенирования с помощью микроспиновых колонок G50, следуя инструкциям производителя. Оцените последовательности лигирования в автоматическом анализаторе последовательностей, как описано выше. Электроферограммы должны быть чистыми и соответствовать одной последовательности иммуноглобулинов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если продукты ПЦР показывают неясные или смешанные последовательности иммуноглобулинов, рассмотрите возможность их клонирования с помощью системы TopoTA, чтобы получить изолированные последовательности, а затем перейдите к шагу 9.

9. Клонирование и секвенирование тяжелых и легких цепочек клонов-производителей IgG

1. Получить 1 мкг ДНК векторов pFUSE2ss-CLIg-hk, pFUSE2ss-CLIg-hl2 и pFUSEss-CHIg-hG1.
2. Расщепляйте эти векторы с помощью соответствующих ферментов рестрикции. Используйте EcoRI и BsiWI для pFUSE2ss-CLIg-hk, EcoRI и AvrII для pFUSE2ss-CLIg-hl2, а также EcoRI и NheI для pFUSEss-CHIg-hG1. Используйте по 3 единицы каждого фермента рестрикции на 1 г ДНК вектора.
   1. Переваривайте с помощью одного фермента и очищайте переваренный продукт с помощью набора для очистки ПЦР. Переварите со вторым ферментом и очистите с помощью набора для экстракции геля (в соответствии с протоколом производителя). Вырежьте интересующий фрагмент из агарозного геля. Приготовьте агарозный гель как в пункте 8.5.
3. Расщепляют продукты^2-й ПЦР продуцентного клона IgG: EcoRI и BsiWI для амплификации каппа-цепи, EcoRI и AvrII для амплификации лямбда-цепи, а также EcoRI и NheI для амплификации тяжелой цепи. Переваривайте с помощью одного фермента и очищайте переваренный продукт с помощью набора для очистки ПЦР. Переварите с помощью второго фермента и очистите переваренный продукт с помощью набора для очистки ПЦР. Используйте те же единицы ферментов и количество ДНК, что и в шаге 9.2.
4. Литраты ПЦР внутри векторов лигировать Т4 ДНК-лигазой 16 °C O/N в соответствии с рекомендациями производителя. Используемое соотношение должно быть 1 : 2 (вектор : вставка).
5. Используйте 1 мкл лигирования для трансформации бактерий DH5α. Следуйте условиям производителя DH5α для преобразования. Распределите бактерии в пластинах бластицидина или цеоцина, в зависимости от типа используемого вектора. Инкубируйте планшеты O/N при 37 °C.
6. Выращивайте одиночные колонии и извлекайте ДНК с помощью мини-набора, следуя инструкциям производителя. Используйте для выращивания одиночной колонии и выделения ДНК от производителя, рекомендации из набора для мини-подготовки ДНК. Проанализируйте их путем разложения с помощью ферментов, используемых для приготовления векторов и вкладышей, как показано в шагах 9.2 и 9.3.
7. Секвенируйте ДНК с использованием 100 нг вектора, как это сделано на этапах 8.8 и 8.9.

10. Производство антител в клетках HEK

1. Выращивайте клетки HEK в модифицированной среде Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) с добавлением 10% эмбриональной сыворотки теленка, 1% L-глюкозы, 1% пенициллина/стрептавидина (DMEM+) до конфлюенции 75% в 150-миллиметровой клеточной культуральной пластине. Выполняют в капюшоне шаг с 10.1 по 10.7.
2. Перед трансфекцией замените среду на среду, как и раньше, но без эмбриональной сыворотки теленка.
3. Для каждой трансфекции с тяжелой легкой цепью приготовьте трансфекционную смесь из 2,5 мл DMEM (без сыворотки), 9 мкг вектора с тяжелой цепью, 6 мкг вектора с легкой цепью и 100 мкл раствора полиэтиленимина (PEI) (из 1 мкг/мкл). Инкубировать при RT в течение 15 минут.
4. Аккуратно добавьте 2,5 мл смеси для трансфекции, приготовленной на шаге 10.3, в клетки HEK в тарелке. Покачайте пластину, чтобы распределить равномерно.
5. Инкубируйте клетки в инкубаторе при температуре 37 °C с 5%_CO2 в течение 24 часов.
6. Смените культуральную среду на среду без фетальной телячьей сыворотки.
7. Соберите среду с тарелок через 4 дня. <бр/> ПРИМЕЧАНИЕ: Антитела в среде могут быть использованы для характеристики их реактивности in vitro и in vivo.

Таблица 1. Используются грунтовки.

1st PCR праймеры
	Нападающий (5'-3')	Реверс (3'-5')
IgG	5′ L-VH 1 ACAGGTGCCCACTCCCAGGTGCAG	3′ Cγ CH1 GGAAGGTGTGCACGCCGCTGGTC
	5 футов L-VH 3 AAGGTGTCCAGTGTGARGTGCAG
	5 футов L-VH 4/6 CCCAGATGGGTCCTGTCCCAGGTGCAG
	5′ L-VH 5 CAAGGAGTCTGTTCCGAGGTGCAG
κ	5′ L Vκ 1/2 ATGAGGSTCCCYGCTCAGCTGCTGG	3′ Cκ 543 GTTTCTCGTAGTCTGCTTTGCTCA
	5′ L Vκ 3 CTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAG	3′ Cκ 494 GTGCTGTCCTTGCTGCTGCT
	5′ L Vκ 4 ATTTCTCTGTTGCTGGATCTCTG
	5′ Pan Vκ ATGACCCAGWCTCCABYCWCCCTG
λ	5′ L Vλ 1 GGTCCTGGGCCCAGTCTGTGCTG	3′ Cλ CACCAGTGTGGCCTTGTTGGCTTG
	5′ L Vλ 2 GGTCCTGGGCCCAGTCTGCCCTG
	5′ L Vλ 3 GCTCTGTGACCTCCTATGAGCTG
	5′ L Vλ 4/5 GGTCTCTCTCSCAGCYTGTGCTG
	5 футов L Vλ 6 GTTCTTGGGCCAATTTTATGCTG
	5′ L Vλ 7 GGTCCAATTCYCAGGCTGTGGTG
	5′ L Vλ 8 GAGTGGATTCTCAGACTGTGGTG
2nd PCR праймеры
	Нападающий (5'-3')	Реверс (3'-5')
IgH	5′ EcoRI VH1 CAACCGGAATTCGCAGGTGCAGCTGG ТГЦАГ	3′ NheI JH 1,2,4,5 CTGCTAGCTAGCTGAGGAGACGGT ГАККАГ
	5′ EcoRI VH1 - 5 CAACCGGAATTCAGAGGTGCAGCTG GTGCAG	3′ NheI JH 3 CTGCTAGCTAGCTGAGAGAGGGTGA КАТТГ
	5′ EcoRI VH3 CAACCGGAATTCAGAGGTGCAGCTG ГТГГАГ	3′ NheI JH 6 CTGCTAGCTAGCTGAGGAGAGAGGGTG ACCGTG
	5′ EcoRI VH3 23 CAACCGGAATTCAGAGGTGCAGCT ГТТГГАГ
	5′ EcoRI VH4 CAACCGGAATTCACAGGTGCAGCT GCAGGAG
	5′ EcoRI VH 4 34 CAACCGGAATTCACAGGTGCAGCTAC АГКАГТГ
	5′ EcoRI VH 1 18 CTTCCGGAATTCACAGGTTCAGCT GGTGCAG
	5′ EcoRI VH 1 24 CTTCCGGAATTCACAGGTCCAGCT ГГТАКАГ
	5′ EcoRI VH3 33 CTTCCGGAATTCACAGGTGCAGCT ГГТГГАГ
	5′ EcoRIVH 3 9 GATCCGGAATTCAGAAGTGCAGCT ГГТГГАГ
	5′ EcoRI VH4 39 GATCCGGAATTCACACAGCTGCAGCT GCAGGAG
	5′ EcoRI VH 6 1 GATCCGGAATTCAGGTACAGCT ГКАГКАГ
κ	5′ EcoRI Vκ 1 5 CAACCGGAATTCAGACATCCAGATGA CCCAGTC	3′ BsiWI Jκ от 1 до 4 GCCACCGTACGTTGATYTCCACCTTGGTC
	5′ EcoR1 Vκ 1 9 CTTCCGGAATTCAGACATCCAGTTGAC CCAGTCT	3′ BsiWI Jκ 2 GCCACCGTACGTTTGATCTCCAG CTTGGTC
	5′ EcoR1 Vκ 1D 43 CTTGGCGAATTCAGCCATCCGGATGA CCCAGTC	3′ BsiWI Jκ 3 GCCACCGTACGTTTGATATCCACT ТТГГТЦ
	5′ EcoR1 Vκ 2 24 CTTCCGGAATTCAGATATTGTGATGA КККАГАК
	5′ EcoR1 Vκ 2 28 CTTCCGGAATTCAGATATTGTGATG ACTCAGTC
	5′ EcoR1 Vκ 2 30 CTTCCGGAATTCAGATGTTGTGATGA CTCAGTC
	5′ EcoR1 Vκ 3 11 CTTCCGGAATTCAGAAATTGTGTTG АКАКАГЦ
	5′ EcoR1 Vκ 3 15 CTTCCGGAATTCAGAAATAGTGATG ACGCAGTC
	5′ EcoR1 Vκ 3 20 CTTCCGGAATTCAGAAATTGTGTTGA CGCAGTCT
	5′ EcoR1 Vκ 4 1 CTTCCGGAATTCAGACATCGTGATG ACCCAGTC
λ	5′ EcoR1 Vλ 1 CTTCCGGAATTCAGTCTGTGCT ГАККАГ	3′ AvrII Jλ от 1 до 3 CTGGTTACCTAGGAGGACGGTSACCT ТГГТССК
	5′ EcoR1 Vλ 2 CTTCCGGAATTCAGTCTGCCC ТГАКТКАГ	3′ AvrII Jλ 4 CTGGTTACCTAGGAAAATGATCAGC ТГГТТТЦ
	5′ EcoR1 Vλ 3 CTTCCGGAATTCATCCTATGAGC TGACWCAG	3′ AvrII Jλ 5 CTGGTTACCTAGGAGGACGGTCAGC ТКГТССК
	5′ EcoR1 Vλ от 4 до 5 CTTCCGGAATTCACACCYTGTG КТГАКТКА	3′ AvrII Jλ 6 CTGGTTACCTAGGAGGACGGTCAGCT ГГГТГКК
	5′ EcoR1 Vλ 6 CTTCCGGAATTCAAATTTTATGC ТГАКТКАГ	3′ AvrII Jλ 7 CTGGTTACCTAGGAGGACGGTCAC ТТГГТЦКАТ
	5′ EcoR1 Vλ от 7 до 8 CTTCCGGAATTCAGRCTG ГТГАЦИКАГ

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Гистопак-1077	Сигма-Олдрич	10771 Номер 10771	раствор, содержащий полисахарозу и диатризоат натрия
Сортировщик клеток FACSAria II	BD Biosciences
96 U-образных пластин для микролунок	Костар	No 3799
Усовершенствованный Мемориальный институт Розуэлл Парк (RPMI) 1640 средний	Gibco, Life Technologies	12633-020
30% v/v ВЭБ-содержащего надосадочной жидкости клеточной линии B95-8	АТКС	КРЛ-1612	3,4 x 108 копий/мл
КПГ2006	Инвивоген	ОДН 7909
Ячейки Wi38	Сигма-Олдрич	90020107
Интерлейкин-2	Рош	10799068001
Планшеты ИФА	Greiner Bio-One, Microlon	655092
AffiniPure F(ab')2 Фрагмент козы античеловеческий IgG, Fcγ фрагмент специфичен (неконъюгирован)	Иммуноисследования Джексона	109-006-008
4% обезжиренное сухое молоко (блокатор блоттинга)	Биорад	170-6404 (Английский)
IgG человека	сигма	И 2511	Иммуноглобулин IgG очищенный, 5,6 мг/мл
Козий F(ab)2 античеловеческий IgG Fcγ (конъюгированный с пероксидазой (PO))	Иммуноисследования Джексона	Тел.: 109-036-008
Считыватель ИФА (Перкин Элмер 2030)	Перкин Элмер	2030-0050
Пероксидаза-конъюгированный AffiniPure Rabbit Anti-Human IgM, Fc5μ	Иммуноисследования Джексона	309-035-095 (Английский
Система прямого синтеза кДНК SuperScript III Cells	Инвитроген	18080-200
Прикладные биосистемы (ABI) GeneAm PCR System 2700	Прикладные биосистемы
Набор для выделения высокочистых РНК	Рош	11828665001
Комплект системы обратной транскрипции	Компания Promega	А3500
Рекомбинантная Taq-ДНК-полимераза	Такара	Р001А
Грунтовки (2 мкл)	сигма
Ультрачистая агароза	Инвитроген	16500-500
Лестница 100 bp	Инвитроген	15628-019
Количество Первое 4.5.2 (Gel Doc 2000)	Биорад	170-8100
Набор для очистки ПЦР QIAquick	ЦИАГЕН	No 28106
Набор для секвенирования цикла BigDye Terminator v3.1	Прикладные биосистемы	4337455
Реакционная пластина 0,1 мл (MicroAMP Optical 96-лунка)	Прикладные биосистемы	4346906
Генетический анализатор ABI300	Прикладные биосистемы	4346906
DH5α компетентные клетки (E. coli)	Инвитроген	18263-012
pFUSEss-CHIg-hG1 (4493.о.)	Инвивоген	Пфузесс-HCHG1
pFUSEss-CHIg-hG4 (4484.н.)	Инвивоген	Пфузесс-HCHG4
pFUSE2ss-CLIg-hk (3875.н.)	Инвивоген	PFUse2SS-HCLK
pFUSE2ss-CLIg-hl2 (3883.н.)	Инвивоген	ПФУС2сс-ГКЛЛ2
SOC средний	Инвитроген	15544-034
Среда на основе агара на основе LB с добавлением Цеоцина (Fast-Media Zeo Agar)	Инвивоген	FAS-ZN-S
Жидкая среда на основе Terrific Broth (TB) с добавлением Zeocin (Fast-Media Zeo TB)	Инвивоген	ФАС-ЗН-Л
Набор DNA Miniprep	Технология Омега Био	Д6942-02
Nanodrop (спектрофотометр ND1000)	Нанокапли
Агаровая среда на основе LB с добавлением Бластицидина (Fast-Media Blast Agar)	Инвивоген	фас-бл-с
Жидкая среда на основе Terrific Broth (TB) с добавлением бластицидина (Fast-Media Blast TB)	Инвивоген	FAS-BL-L
ЭкоРИ	Биолаборатории Новой Англии	Р0101С	20 000 ед/мл, в 10x NEBuffer EcoRI
NheI	Биолаборатории Новой Англии	Р0131С	10 000 ед/мл, в 10x NEBuffer 2.1
Лестница из 2 бревен ДНК	Биолаборатории Новой Англии	Н3200С	0,1-10,0 кб, 1 000 мкг/мл
XmaI	Биолаборатории Новой Англии	Р0180С	10 000 ед/мл, в 10-кратном буфере CutSmart
BsiWI	Биолаборатории Новой Англии	Р0553С	10 000 ед/мл, в 10x NEBuffer 3.1
Авр II	Биолаборатории Новой Англии	Р0174С	5 000 ед/мл, в 10-кратном буфере CutSmart
FastAP Термочувствительная щелочная фосфатаза	Термо Сайентиал	ЭФ0651	1 U/μL, в 10-кратном буфере FastAP
Компетентные клетки DH5α	Инвитроген	18263-012
Мышь PE Anti-Human IgG	BD Pharmingen	555787
анти-CD22, PerCP-Cy5.5, клон: HIB22	Научный Фишер	BDB563942
QIAprep Spin Мини-набор	ЦИАГЕН	No 27106
Терминатор BigDye v3.1	Прикладные биосистемы	4337455

) для подготовки