Гибридомная технология получения моноклональных антител против металлопептидазы

Аннотация

Источник: Xia, P., et al. Производство моноклональных антител, нацеленных на аминопептидазу N, в эпителии слизистой оболочки кишечника свиней. J. Vis. Exp. (2021).

Это видео демонстрирует анализ производства моноклональных антител против свиной аминопептидазы N (APN), мембранно-связанной металлопептидазы, с использованием традиционной гибридомной технологии. После иммунизации мыши APN клетки селезенки собирают и сливают с бессмертными клетками миеломы для получения гибридом. Затем гибридомы отбирают и пролиферируют с использованием среды HAT (гипоксантин-аминоптерин-тимидин) для получения моноклональных антител, специфичных к различным эпитопам APN.

Протокол

Все процедуры на животных были проверены местным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Иммунизация животных

1. Подкожно (s.c) вводите самкам мышей BALB/c в возрасте 6-8 недель 50 мкг белка APN или фосфатно-солевого буфера (PBS, отрицательный контроль) в смеси с адъювантами один раз в 2 недели. Используйте полный адъювант Фройнда, содержащий убитые теплом микобактерии для первичной иммунизации, и неполный адъювант Фройнда для бустерной иммунизации. Смешайте равные объемы белка APN (или PBS) и адъюванта Фрейнда или неполного адъюванта Фрейнда соответственно.
2. Определение титров антител против APN в сыворотке крови этих мышей с помощью непрямого иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием микротитрового планшета, покрытого белком APN 5 мкг/мл, разведенным в 0,05 М PBS (pH 9,6).

2. Гибридомная технология для производства моноклональных антител против APN

1. Внутрибрюшинно (в/в) введите 100 г белка APN выбранным мышам для окончательного усиления антигена.
2. Через три дня усыпьте мышей с помощью пентобарбитала натрия (50 мг/кг, v/v, внутрибрюшинно) и вывиха шейки матки.
3. Соберите селезенку, и дважды промойте ДМЭМ, чтобы удалить кровь и жировые клетки. Отфильтруйте суспензию клеток селезенки с помощью медной сетки 200 меш для удаления остатков тканей и соберите клетки селезенки с помощью центрифугирования (1500 × г, 10 мин) для удаления мембраны селезенки.
4. Семена клеток мышиной миеломы SP2/0 в колбе 2 см 2 см2, содержащей 5 мл модифицированной среды Dulbecco Eagle Media (DMEM) с добавлением 6% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и посеве при 37 °C, 6% атмосферы_CO2 для поддержания жизнеспособности клеток. Через 5-6 дней культивирования клетки достигают 80%-90% слияния после реанимации и находятся в фазе регистрации роста. Под микроскопом клетки круглые, яркие и прозрачные.
5. За сутки до гибридизации соберите макрофаги из брюшных полостей мышей по ранее опубликованному методу.
6. Затравливают перитонеальные макрофаги при плотности 0,1-0,2 × 10⁵/мл в 96-луночных планшетах, каждая лунка которых содержит 100 мкл среды HAT (DMEM с добавлением 10% FBS и 1x добавку HAT), и инкубируют при 37 °C, 6 % CO₂ увлажненной атмосфере в течение ночи.
7. Для гибридизации аккуратно аспирируют клетки SP2/0 с помощью пипетки из 8-10 флаконов и суспензируют в 10 мл бессывороточной среды DMEM. Промойте ячейки свежим DMEM, центрифугой (1500 × г, 10 мин) дважды, а затем повторно суспендируйте в 10 мл DMEM.
8. Смешайте количественно определенные клетки селезенки с клетками SP2/0 в соотношении 10:1 и перенесите в пробирки объемом 50 мл. Центрифугируйте (1500 × г, 10 мин) и выбросьте надосадочную жидкость. Соберите гранулы клеток на дно пробирок и постучите ладонью, чтобы разрыхлить гранулы перед гибридизацией.
9. Добавьте 1 мл полиэтиленгликоля 1500 (PEG 1500), предварительно нагретого до 37 °C, по каплям с помощью пипетки в разрыхленную гранулу ячейки в течение 45 с, осторожно вращая дно пробирки.
10. Медленно добавьте в вышеуказанную смесь 1 мл предварительно подогретого до 37 °C DMEM в течение 90 с, после чего добавьте еще 30 мл свежего DMEM. Поместите плавильную трубку в водяную баню при температуре 37 °C на 30 минут.
11. После инкубации в теплой ванне соберите клетки и повторно суспендируйте в среде HAT. Затем культивирование в 96-луночный планшет инокулировали перитонеальными макрофагами.
12. Через пять дней добавьте по 100 мкл свежей среды HAT в каждую лунку и инкубируйте планшет еще 5 дней, после чего замените среду на среду HT (DMEM с добавлением 10% FBS и 1x добавкой HT).
13. Используйте микротитровальную пластину, покрытую белком APN 5 мкг/мл, разведенным в 0,05 М PBS (pH 9,6), для анализа моноклональных антител в супернатанте гибридомы с помощью анализа ИФА.
    1. Когда среда в лунках 96-луночного планшета становится желтой (из-за роста клеток и выделения метаболитов pH в среде снижается до 6,8, а фенольный красный превращается из фуксии в желтый) или наблюдаются кластеры клеток, приобретайте 100 мкл надосадочной жидкости из выбранных лунок и добавляйте в лунки покрытого планшета ИФА. Используйте считыватель микропланшетов для измерения значений наружного диаметра₄₅₀.
    2. Используйте поликлональные антитела против APN и неинфицированной сыворотки мышей в качестве положительного и отрицательного контроля соответственно, а также используйте PBS в качестве холостого контроля. В данном исследовании отношение OD₄₅₀ образца к отрицательному контролю (P/N) ≥ 2,1 было признано стандартом положительного отбора.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Полный адъювант Фрейнда	Сигма-Олдрич	Ф5881	Иммунизация животных
DMEM	Gibco	11965092	Культура клеток
ДМЭМ-Ф12	Gibco	12634010	Культура клеток
Расширенный набор для подсчета ячеек-8	Beyotime Biotechnology	С0042	Измерение жизнеспособности и жизнеспособности клеток
Фетальная бычья сыворотка	Gibco	10091	Культура клеток
Селективный антибиотик генетина™	Gibco	11811098	Селективный антибиотик
Пищевая добавка HAT (50X)	Gibco	21060017	Выбор ячеек
Добавка HT (100X)	Gibco	11067030	Выбор ячеек
Неполный адъювант Фрейнда	Сигма-Олдрич	Ф5506	Иммунизация животных
Считыватель микропланшетов	БиоТек	БОКС 998	Анализ методом ИФА
Полиэтиленгликоль 1500	Рош Диагностика	10783641001	Слияние ячеек
96-луночный микропланшет	Корнинг	No 3599	Культура клеток