Способ получения рекомбинантных антител против металлопептидазы

Аннотация

Источник: Xia, P. et al., Производство моноклональных антител, нацеленных на аминопептидазу N, в эпителии слизистой оболочки кишечника свиньи.J. Vis. Exp.(2021)

Это видео демонстрирует процедуру производства рекомбинантных антител против металлопептидазы. Рекомбинантные плазмиды, несущие гены антитела, зеленого флуоресцентного белка и устойчивости к антибиотикам, трансфицируются в эпителиальные клетки с помощью липофектамина. Трансфицированные клетки отбирают и культивируют для получения рекомбинантных антител.

Протокол

1. Получение антигена белка N-образной аминопептидазы свиней (APN)

ПРИМЕЧАНИЕ: Штамм pET28a (+)-APN-BL21 (DE3) и стабильно экспрессируемые APN клетки pEGFP-C1-APN-IPEC-J2 были сконструированы в предыдущем исследовании.

1. Извлеките бактерии из замороженного глицерина и нанесите их на планшеты Лурии-Бертани (LB), содержащие 50 мкг/мл канамицина (Km⁺) для выделения одной колонии.
2. Выберите одну колонию из только что прорезанной пластины, посейте в 4 мл LB среды (10 г/л триптона, 10 г/л хлорида натрия (NaCl) и 5 г/л дрожжевого экстракта, pH 7,2) с добавлением Km⁺ (50 мкг/мл) и оставьте расти на ночь (12-16 ч) с перемешиванием (178 об/мин) при 37 °C.
3. Подготовленные бактерии развести в 1:100 в свежем бульоне Km⁺ LB и инкубировать при 37 °C с встряхиванием в течение 2-3 ч до тех пор, пока наружный диаметр₆₀₀ не достигнет 0,4-0,6.
4. Добавьте изопропил β-d-1-тиогалактопиранозид (IPTG) в среду до конечной концентрации 0,4 мМ и инкубируйте культуры в течение еще 10 ч при 16 °C.
5. Затем центрифугируйте и собирайте бактерии с помощью индукции IPTG (10 000 × г, 4 °C 15 мин).
6. Ресуспендируйте клеточную гранулу с помощью 5 мл буфера LEW (Lysis/Equilibration/Wash) (50 мМ безводного одноосновного фосфата натрия (₂PO₄) и 300 мМ NaCl, pH 8,0), содержащего 1 мг/мл лизоцима. Перемешайте бактериальную суспензию на льду в течение 30 мин и полностью обработайте ультразвуком (импульс 15 с и выключение 20 с, 15 мин) с помощью ультразвукового гомогенизатора.
7. Центрифугируйте сырой клеточный лизат при 4 °C и 10 000 × г в течение 30 минут для удаления клеточного мусора. Переложите надосадочную жидкость в предварительно уравновешенную колонну и инкубируйте за 1-2 минуты до самотечного дренажа. Повторите этот шаг три раза.
8. Промойте колонку, используя 20 мл буфера LEW, и слейте воду под действием силы тяжести. Разбавьте меченный гистидином белок APN с использованием 9 мл элюирующего буфера (50 мМ₂PO₄, 300 мМ NaCl и 250 мМ имидазола, pH 8,0) и соберите в диализную трубку.
9. Провести диализ белкового раствора в течение ночи при 4 °C в буфере карбонат-бикарбонат натрия (фосфатно-солевой буфер (PBS), 135 мМ NaCl, 4,7 мМ хлорида калия, 2 мМ₂PO₄ и 10 мМ додекагидрат натрия фосфат двухосновный, pH 7,2).
10. Анализируйте с помощью геля SDS-PAGE 12,0% и вестерн-блоттинга для оценки чистоты белка APN.
    1. Загрузите по 5 г белка в каждую лунку геля и дайте поработать при напряжении 110 В в течение 1,5 ч. Затем перенесите белок на мембрану из поливинилиденфторида (PVDF) в течение 50 мин при 15 В. Определите концентрацию очищенного белка с помощью анализа бицинхониновой кислоты (BCA).

2. Иммунизация животных

1. Подкожно (s.c) вводите самкам мышей BALB/c в возрасте 6-8 недель 50 мкг белка APN или PBS (отрицательный контроль) в смеси с адъювантами один раз в 2 недели. Используйте полный адъювант Фройнда, содержащий убитые теплом микобактерии для первичной иммунизации, и неполный адъювант Фройнда для бустерной иммунизации. Смешайте равные объемы белка APN (или PBS) и адъюванта Фрейнда или неполного адъюванта Фрейнда соответственно.
2. Определение титров антител против APN в сыворотке крови этих мышей с помощью непрямого иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием микротитрового планшета, покрытого белком APN 5 мкг/мл, разведенным в 0,05 М PBS (pH 9,6).

3. Гибридомная технология для производства моноклональных антител против APN

1. Внутрибрюшинно (в/в) введите 100 г белка APN выбранным мышам для окончательного усиления антигена.
2. Через три дня усыпьте мышей с помощью пентобарбитала натрия (50 мг/кг, v/v, внутрибрюшинно) и вывиха шейки матки.
3. Соберите селезенку и дважды промойте модифицированной средой Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM), чтобы удалить клетки крови и жира. Отфильтруйте суспензию клеток селезенки с помощью медной сетки 200 меш для удаления остатков тканей и соберите клетки селезенки с помощью центрифугирования (1500 × г, 10 мин) для удаления мембраны селезенки.
4. Семена клеток мышиной миеломы SP2/0 в колбе 25^см2, содержащей 5 мл DMEM, с добавлением 6% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и посеве при температуре 37 °C, 6% углекислого газа (CO₂) атмосферы для поддержания жизнеспособности клеток. Через 5-6 дней культивирования клетки достигают 80%-90% слияния после реанимации и находятся в фазе регистрации роста. Под микроскопом клетки круглые, яркие и прозрачные.
5. За сутки до гибридизации соберите макрофаги из брюшных полостей мышей по ранее опубликованному методу.
6. Семена перитонеальных макрофагов при плотности 0,1-0,2 × 10⁵/мл в 96-луночных планшетах, каждая лунка которых содержит 100 мкл гипоксантин-аминоптерин-тимидиновой среды (АТЧ) (ДМЭМ с добавлением 10% FBS и 1х добавки АТЧ), и инкубируют при 37 °С, 6 %_СО2 увлажненной атмосферы в течение ночи.
7. Для гибридизации аккуратно отсасывают клетки SP2/0 с помощью пипетки из 8-10 флаконов и суспендируют в 10 мл бессывороточной среды DMEM. Промойте ячейки свежим DMEM, центрифугой (1500 × г, 10 мин) дважды, а затем повторно суспендируйте в 10 мл DMEM.
8. Смешайте количественно определенные клетки селезенки с клетками SP2/0 в соотношении 10:1 и перенесите в пробирки объемом 50 мл. Центрифугируйте (1500 × г, 10 мин) и выбросьте надосадочную жидкость. Соберите гранулы клеток на дно пробирок и постучите ладонью, чтобы разрыхлить гранулы перед гибридизацией.
9. Добавьте 1 мл полиэтиленгликоля 1500 (PEG 1500), предварительно нагретого до 37 °C, по каплям с помощью пипетки в разрыхленную гранулу ячейки в течение 45 с, осторожно вращая дно пробирки.
10. Медленно добавьте в вышеуказанную смесь 1 мл предварительно подогретого до 37 °C DMEM в течение 90 с, после чего добавьте еще 30 мл свежего DMEM. Поместите плавильную трубку в водяную баню при температуре 37 °C на 30 минут.
11. После инкубации в теплой ванне соберите клетки и повторно суспендируйте в среде HAT. Затем культивирование в 96-луночный планшет инокулировали перитонеальными макрофагами.
12. Через пять дней добавьте по 100 мкл свежей среды HAT в каждую лунку и инкубируйте планшет еще 5 дней, после чего замените среду на среду HT (DMEM с добавлением 10% FBS и 1x добавкой HT).
13. Используйте микротитровальную пластину, покрытую белком APN 5 мкг/мл, разведенным в 0,05 М PBS (pH 9,6), для анализа моноклональных антител в супернатанте гибридомы с помощью анализа ИФА.
    1. Когда среда в лунках 96-луночного планшета становится желтой (из-за роста клеток и выделения метаболитов pH в среде снижается до 6,8, а фенольный красный превращается из фуксии в желтый) или наблюдаются кластеры клеток, приобретайте 100 мкл надосадочной жидкости из выбранных лунок и добавляйте в лунки покрытого планшета ИФА. Используйте считыватель микропланшетов для измерения значений оптической плотности 450 (OD450).
    2. Используйте поликлональные антитела против APN и неинфицированной сыворотки мышей в качестве положительного и отрицательного контроля соответственно, а также используйте PBS в качестве холостого контроля. В данном исследовании отношение OD450 образца к отрицательному контролю (P/N) ≥ 2,1 было признано стандартом положительного отбора.
14. После трех последовательных раундов положительного отбора выберите гибридому, демонстрирующую повышенный серологический ответ на белок APN, для ограниченного анализа разведения.
    1. Подготовьте перитонеальные макрофаги и затравку в 96-луночных планшетах, как описано ранее.
    2. Суспензируют гибридомные клетки в среде HT в среднем по 0,5-2 клетки на лунку и культивируют в инкубаторе с температурой 37 °С, 6%_СО2. Повторите этот шаг три или четыре раза, пока уровень положительных результатов, показанный иммуноферментным анализом, не достигнет 100%.
15. Под давлением непрерывного замораживания и размораживания отбирают положительные гибридомные клетки, способные стабильно секретировать анти-APN антитела и нормально размножаться.
    1. Однократное внутримышечное введение 0,3 мл пристана каждой мыши (8-10 недель). Через 10 дней после получения первозданного препарата введите каждой мыши 2-5 x 10⁵ гибридомных клеток в 0,5 мл PBS (pH 7,2).
    2. Тщательно соберите перитонеальную жидкость из брюшной полости этих мышей через 8-10 дней после инъекции.
    3. Соберите надосадочную жидкость центрифугированием при 5000 × г в течение 15 мин и очистите антитела в надосадочной жидкости с использованием 33% насыщенного сульфата аммония [(NH₄)₂SO₄] осадка и белка А агарозы.

4. Характеристика моноклональных антител (mAb) против белка APN

1. Определите подтип иммуноглобулина собранных mAb с помощью SBA Clonotyping System-HRP. Используйте SDS-PAGE и вестерн-блоттинг для оценки чистоты и специфичности mAb.
2. Анализ специфичности эпитопов mAb по отношению к белку APN с помощью иммуноферментного анализа. Значение аддитивности (AV) — это отношение_{OD mAbs (a+b)} к (OD_mAbs-a+OD_mAbs-b), которое используется для оценки того, распознают ли mAb один и тот же антигенный сайт; OD_mAbs-a и OD_mAbs-b представляют значения OD450 различных моноклональных антител против только APN, а_{OD mAbs (a+b)} представляют значения OD450 смеси двух mAb в соотношении 1:1 против APN.
   1. Оцените каждый образец по крайней мере четыре повторения и повторите весь эксперимент не менее трех раз.

5. Экспрессия rAbs против APN

1. Извлечь общую РНК из вышеупомянутых гибридомных клеток и селезенки мышей, иммунизированных APN (например, TRIzol). Синтезируйте комплементарную ДНК (кДНК) с помощью набора для синтеза кДНК в соответствии с инструкциями производителя.
2. Амплификация вариабельных областей мАТ с помощью вложенной полимеразной цепной реакции (ПЦР) и определение последовательностей тяжелых цепей (VH) и легких цепей (VL) с помощью секвенирования. Проанализируйте гены, кодирующие VH и VL, с помощью инструмента анализа генома мыши IMGT (http://www.imgt.org/about/immunoinformatics.php).
3. Объедините гены VH и VL с лидерными последовательностями и последовательно субклонируйте их в векторы pET28a (+) и pIRES2-ZsGreen1 соответственно, используя технологию бесшовного клонирования, чтобы обеспечить вставку фрагментов ДНК без шрамов. Конкретные грунтовки перечислены в таблице 1.
4. Выращивайте трансформированные бактерии pET28a (+)-rAbs-APN-BL21 в присутствии 0,4 мМ IPTG в орбитальных вибростендах при 37 °C в течение 10 ч. Затем индуцируйте, очистите и оцените экспрессию белка rAbs с помощью обычной очистки белка.
5. Высевают 100 мкл 0,5 x 10⁵ клеток CHO в лунку в 96-луночный планшет и инкубируют при 37 °C в атмосфере 6%_CO2 в течение 18-24 ч. Когда клетки достигнут 80-90% конфлюенции, разбавьте плазмиду pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN с помощью Opti-MEM до конечной концентрации 0,1 мкг/мкл и инкубируйте 5 минут при комнатной температуре перед использованием для трансфекции.
6. Аккуратно смешайте 50 мкл разведенной плазмиды pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN с 1 мкл Lipofectamine 2000 и 49 мкл Opti-MEM и инкубируйте смесь еще 20 минут при комнатной температуре. Добавьте по 100 мкл смеси в каждую лунку 96-луночного планшета, содержащего СНО, и инкубируйте при 37 °С в атмосфере 6%_СО2 в течение 4-6 ч.
7. Через 4-6 ч после трансфекции замените среду средой DMEM-F12 с добавлением 10% FBS и инкубируйте планшет еще 48 ч. Затем добавьте 400 мкг/мл G418 в каждую лунку, чтобы выбрать стабильно трансфицированные клетки.
8. После 10 дней отбора с использованием среды DMEM-F12 с добавлением 10% FBS и 400 мкг/мл G418 отсортируйте клетки (3,0 × 10⁷ клеток/мл) с помощью флуоресцентно-активируемой сортировки клеток. Примерно 10-15% клеточной популяции были положительными.
9. Последовательно разводят собранные положительные клетки, затравливают в среднем по 0,5-2 клетки на лунку в 96-луночном планшете и культивируют в инкубаторе с температурой 37 °С, 6%_СО2. Поддерживайте стабильно трансфицированные клетки pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO с помощью селекции с помощью G418 (200 мкг/мл).
10. Концентрация FBS в описанной выше среде для клеточных культур постепенно снижается от 10% до 0% в фазе логарифмического роста в течение 3 недель. Затем адаптируют адгезивные клетки СНО к росту суспензии в среде, не содержащей сыворотки.
11. Культивируют высеянные клетки pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO в логарифмической фазе роста в бессывороточной среде с плотностью 0,8-1,0 ×^{10 5} клеток/мл в колбах при скорости встряхивания 80-110 об/мин и 37°С, 6%_СО2.
12. Собирайте клеточную суспензию каждые 12 ч для определения изменений жизнеспособности и жизнеспособности клеток с помощью набора для подсчета клеток (например, CCK-8) в соответствии с инструкциями производителя.
13. Экспрессия антител достигает пиковых уровней, когда жизнеспособность клеток снижается до 80% и плотность клеток достигает 1,0-2,0 × 10⁶ клеток/мл. Соберите надосадочную жидкость клеток с помощью центрифугирования, отфильтруйте с помощью мембранного фильтра из политетрафторэтилена 0,22 мкм и очистите с помощью белка А агарозы.
14. Подтвердите выработку APN-специфических антител с помощью непрямого иммунофлуоресцентного анализа (ИФА).
15. Определите титры антител и аффинность связывания с помощью иммуноферментного анализа, как описано ранее. Рассчитайте константу диссоциации равновесия (значение K_D) антител с помощью четырехпараметрического логистического уравнения с помощью программного обеспечения.

Таблица 1. Конкретные праймеры, использованные в данном исследовании.

букварь	Последовательность (5'-3')
VH-VL-F	CCGGGTGGGCCGGATAGACMGATGGGGCTG
VH-VL-R	CCGGCCACATAGGCCCCACTTGACATTGATGT
pET28a (+)-F	TCCACCAGTCATGCTAGCCATAACAACGGTCGTGATTCGA
pET28a (+)-R	CTGGTGCCGCGCGGCAGCCAGTGGGATACCCGTACCC
pIRES2-ZsGreen1-F	CGACGGTACCGCGGGCGGCGGTAACAACGGTCGTGATTCGA
pIRES2-ZsGreen1-R	ГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГГАТАЧЧ

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Полный адъювант Фрейнда	Сигма-Олдрич	Ф5881	Иммунизация животных
DAPI	Beyotime Biotechnology	С1002	Ядерное противодействие
DMEM	Gibco	11965092	Культура клеток
ДМЭМ-Ф12	Gibco	12634010	Культура клеток
Dylight 549-конъюгированное козье вторичное антитело к мышиному IgG	Аббкин	А23310	Непрямой иммунофлуоресцентный анализ
Расширенный набор для подсчета ячеек-8	Beyotime Biotechnology	С0042	Измерение жизнеспособности и жизнеспособности клеток
Фетальная бычья сыворотка	Gibco	10091	Культура клеток
Селективный антибиотик генетина™	Gibco	11811098	Селективный антибиотик
Пищевая добавка HAT (50X)	Gibco	21060017	Выбор ячеек
Добавка HT (100X)	Gibco	11067030	Выбор ячеек
Неполный адъювант Фрейнда	Сигма-Олдрич	Ф5506	Иммунизация животных
Изопропил β-d-1-тиогалактопиранозид	Сигма-Олдрич	И5502	Экспрессия белка
канамицин	Beyotime Biotechnology	СТ102	Бактерицидный антибиотик
Конфокальный микроскоп Leica TCS SP8 STED	Leica Microsystems	Шпилька SP8	Флуоресцентная визуализация
Реагент Липофектамин® 2000	Термофишер	11668019	Трансфекция
Сортировка флуоресцентно-активируемых клеток LSRFortessa™	БД	FACS LSRFortessa	Проточная цитометрия
Считыватель микропланшетов	БиоТек	БОКС 998	Анализ методом ИФА
Микроспектрофотометр	Термо Фишер	Nano Drop one	Определение концентрации нуклеиновых кислот
NaCl	Химический реагент Sinopharm	10019308	Культуральный отвар
(NH4)2SO4	Химический реагент Sinopharm	10002917	Культуральный отвар
Opti-MEM	Gibco	31985088	Культура клеток
Полиэтиленгликоль 1500	Рош Диагностика	10783641001	Слияние ячеек
Набор для синтеза кДНК PrimeScript™ 1st String	Биография Такара	РР047	количественной ПЦР
Белок А агарозный	Beyotime Biotechnology	П2006	Очистка белка на основе антител
Насадочные колонны Protino® Ni+-TED 2000	МАЧЕРИ-НАГЕЛЬ	745120.5	Очистка белка
Система клонотипирования SBA-HRP	Южная биотехнология	Май-00	Изотипирование моноклональных антител мыши
Комплект для бесшовного клонирования	Beyotime Biotechnology	Д7010С	Конструирование плазмид
Встряхивайте колбы	Beyotime Biotechnology	Е3285	Культура клеток
Карбонат-бикарбонат натрия буфер	Beyotime Biotechnology	С0221А	Культура клеток
Trans-Blot SD Полусухая передаточная ячейка	Био-рад	170-3940	Вестерн-блот
Триптон	Оксоидный	ЛП0042	Культуральный отвар
Ультразвуковой гомогенизатор	Нинбо Синьчжи Биотехнология	ЮИ92-ИИН	Гомогенизация образцов
Дрожжевой экстракт	Оксоидный	ЛП0021	Культуральный отвар
96-луночный микропланшет	Корнинг	No 3599	Культура клеток

Кабель