Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.
1. Выделение PBMC и обогащение/очистка NK-клеток
ПРИМЕЧАНИЕ: Также могут быть выполнены другие методы выделения мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) и обогащения/очистки.
- Наберите 200 мл крови в регулируемых условиях в пробирку, содержащую гепарин.
- Добавьте 15 мл градиентной среды плотности в пробирку объемом 50 мл со встроенным пористым барьером. Вращайте трубку при давлении 1000 x g в течение 30 с.
- Добавьте в пробирку 12,5 мл крови, затем еще 12,5 мл PBS и аккуратно переверните 3 раза. Вращайте пробирку при 800 x g в течение 15 минут при комнатной температуре (RT) без перерывов.
- Приготовьте коническую пробирку объемом 50 мл с 40 мл PBS для каждой пробирки с пористым барьером, пока клетки вращаются.
- Осторожно извлеките пробирки и осмотрите после центрифугирования. Проверьте наличие тонкого, заметно белого слоя PBMC над пористым барьером, между границами 20 мл и 25 мл на трубке объемом 50 мл.
- Осторожно удалите как можно больше жидкости сверху с помощью пипетки, не нарушая тонкий белый слой PBMC.
- С помощью чистой серологической пипетки объемом 10 мл аккуратно удалите слой PBMC в дополнение к прозрачному желтоватому слою жидкости вплоть до фильтра пробирки.
- Вытесните PBMC и жидкость в коническую форму объемом 50 мл, содержащую PBS, приготовленную на шаге 1.4. Вращайте трубки при температуре RT и 300 x g в течение 5 минут.
- Отсадите средство для мытья PBS и добавьте еще 40 мл PBS. Вращайте трубки при температуре RT и 300 x g в течение 5 минут.
- После промывки подсчитайте клетки и повторно суспендируйте их в 40 μл 2% BSA/PBS на 1 x 107 клеток.
- Приступают к выделению NK-клеток с помощью выбранного метода выбора. На выбор предлагается ручная или автоматическая сортировка на основе магнитных шариков. Также может быть выполнена флуоресцентно-активируемая сортировка клеток.
- Удалите небольшую аликвоту клеток, чтобы определить чистоту NK-клеток методом проточной цитометрии. Стратегия стробирования включает в себя следующее: затвор на живых клетках на основе профиля прямого и бокового рассеяния, затем оценка чистоты на основе маркеров NK (например, CD3, CD56) в конкретной живой популяции. Типичная чистота составляет >95%.
- После завершения выделения спин-клетки при ОТ и 300 х Г в течение 5 мин для гранулирования и аспирации.
- Ресуспендируйте клеточную гранулу до 1 x 107 клеток/мл в RPMI 1640 с питательными веществами, 10% инактивированным при нагревании FBS, 1 мМ пируватом натрия, 55 мМ 2-МЭ и 10 мМ HEPES (pH = 7,2).
2. Антитело-опосредованная активация NK-клеток через FcγRIIIa
- Установите охлаждаемую микроцентрифугу на 4 °C.
- Диспонируйте 1 x 106 (100 μл) ресуспендированных NK-клеток в пробирку (пробирки) объемом 1,5 мл и поместите на лед.
заметка: Элементы могут быть дозированы в 96-луночную U-образную пластину, если имеется большое количество образцов.
- Приготовьте 1 мкл 100 мкг/мл ритуксимаба (или представляющего интерес антитела) на каждый образец и добавьте 1 мкл в клетки для получения конечной концентрации 1 мкг/мл антитела.
заметка: Другие молекулы могут быть добавлены в клетки на этом этапе или ранее для оценки комбинированных эффектов. Здесь для стимуляции использовался ритиксумаб. В предыдущих исследованиях к стимуляции добавлялись низкомолекулярные ингибиторы.
- Инкубируйте образец на льду в течение 30 минут. Во время инкубации приготовьте 50 мкл антитела 50 мкг/мл против легкой цепи κ человека на образец в среде и нагрейте до 37 °C на тепловом блоке или на водяной бане.
- После инкубации клеток на льду добавьте 1 мл ледяной среды и отверните при 135 x g в течение 5 минут при 4 °C. Снова промойте 1 мл ледяной среды.
- Отсадите надосадочную жидкость после последней промывки и добавьте 50 мкл античеловеческой смеси легкой цепи, приготовленной на шаге 2.4.
- Немедленно инкубируйте образцы для определенных конечным пользователем временных точек при температуре 37 °C на тепловом блоке или на водяной бане.
- Прекратите стимуляцию, добавив 1 мл ледяной среды, и немедленно открутите образцы в охлаждаемой центрифуге при 135 x g в течение 5 мин. Промойте еще раз 1 мл ледяной среды.
