Метод получения моноклональных антител из антиген-специфических В-клеток

Аннотация

Источник: Devilder, M., et al. Генерация дискриминирующих моноклональных антител человека из редких антиген-специфических В-клеток, циркулирующих в крови. J. Vis. Exp. (2018).

Видео демонстрирует технику получения моноклональных антител из антиген-специфических В-клеток. Эукариотические векторы экспрессии, кодирующие тяжелую и легкую цепи антител, клонированные из выделенных антиген-специфических В-клеток, вводят в клетки млекопитающих с помощью полиплексов. Попадая внутрь клеток, эти векторы претерпевают трансляцию, и полученные пептиды тяжелой и легкой цепи собираются в антитела, которые впоследствии секретируются клетками.

Протокол

1. Производство мАТ

1. За день до трансфекции засейте 15 000 клеток человеческого эмбриона почки 293A (HEK 293A) в 200 мкл модифицированной среды Dulbecco Eagle Media (DMEM) с добавлением 10% FBS на лунку в 96-луночных планшетах. Инкубировать в течение ночи в инкубаторе с_СО2 (5%_СО2) при температуре 37 °C.
2. Котрансфект 293А клеток в среде DMEM, содержащей 10% FBS, с использованием линейного производного полиэтиленимина в качестве реагента для трансфекции.
   заметка: Проводят трансфекцию в трех экземплярах. Следующий протокол предназначен для одной лунки 96-луночного планшета с плоским дном.
   1. Развести 0,5 мкл реагента для трансфекции ДНК в 10 мкл 150 мМ NaCl. Разбавьте 0,125 мкг переменной тяжелой цепи (vH) и 0,125 мкг переменной легкой цепи (vL), экспрессирующих векторы, в 10 мкл 150 мМ NaCl. Вихревое каждое разведение в течение 10 с.
   2. Добавьте 10 мкл разбавленного реагента для трансфекции ДНК в 10 мкл раствора ДНК. Вихрь 15 с и инкубировать в течение 15 мин при комнатной температуре. Добавьте смесь объемом 20 мкл по каплям на элементы 293A и перемешайте, осторожно поворачивая пластину.
3. Замените среду через 16 ч после трансфекции и культивируйте клетки в течение 5 дней в среде, не содержащей сыворотки.
   заметка: Используйте среду, не содержащую сыворотки, чтобы избежать загрязнения вырабатываемых антител сывороточными иммуноглобулинами (Igs).
4. Удалите клетки и мусор путем центрифугирования при 460 x g в течение 5 минут.
5. Соберите надосадочную жидкость путем аспирации с помощью многоканальной пипетки и перенесите их в 96-луночный планшет с V-образным дном.
6. Покройте соответствующий Ag в течение ночи при 4 °C в 100 мкл на лунку восстановленного иммуноферментного анализа (ИФА)/иммуноферментного пятна (ELISPOT) в буфере для покрытия 1x при конечной концентрации 2 мкг/мл в 96-луночных ИФА-планшетах.
7. Закупорить лунки средой FBS DMEM на 2 ч при 37 °С.
8. Добавьте 50 мкл надосадочной жидкости трансфицированных клеток 293A на этапе 1,5 и инкубируйте в течение 2 ч при ЛТ.
9. Добавьте 100 мкл антитела к иммуноглобулину G человека (IgG Ab), конъюгированного с ферментом пероксидазой хрена (HRP) в концентрации 1 мкг/мл и инкубируйте в течение 1 ч при комнатной температуре. Добавьте 50 μL хромогенного субстрата (3,3',5,5' тетраметилбензидин, TMB) и инкубируйте в течение 20 минут.
10. Считывание оптических плотностей на длине волны 450 нм на спектрофотометре.
    заметка: Специфические мАТ, выявленные с помощью ИФА-анализа, могут быть в дальнейшем получены в больших масштабах и очищены на колонке белка А, обладающей сродством к человеческому IgG.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Клеточная линия HEK 293A	Thermo Fisher scientific	Р70507
DMEM (1X) Модифицированный Eagle Medium от Dulbecco	Gibco от life technologies	21969-035	(+) 4,5 г/л D-глюкозы 0,11 г/л пирувата натрия (-) L-глюмин
Нутридома-СП	Рош	11011375001	100X Conc
Фетальная бычья сыворотка (FBS)	Доминик Датчер	С1810-500
Реагент для трансфекции ДНК Jet PEI	ПолиПлюс	101-40
Плоское дно96-луночный планшет	сокол	353072
96-луночный планшет с V-образным дном	Нунк/Термофишер	No 55142

Телефон