Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Подготовка шаговых катетеров
- Подготовка трубки из плавленого кремнезема к этапу катетера
- Разрежьте капилляр из плавленого кремнезема с внутренним диаметром 0,1 мм и толщиной стенки 0,0325 мм трубку до длины 30 мм.
- Осмотрите трубку на наличие трещин и отполируйте ее концы с помощью микрокузницы, чтобы убедиться, что отверстия трубки имеют гладкую поверхность.
- Фиксация внутренней трубки в металлической игле
- Установите иглу 27 G на шприц объемом 10 мкл и поместите шприц в стереотаксический робот.
- С помощью робота переместите шприц по твердой поверхности и коснитесь его кончиком иглы. Это положение должно быть отмечено или сохранено в программном обеспечении, потому что оно будет служить опорной поверхностью для установки длины шага катетера.
- Поднимите иглу, чтобы капилляр из плавленого кремнезема поместился внутрь иглы.
- Поместите капилляр из плавленого кремнезема в иглу таким образом, чтобы капилляр выступал из иглы на 20 мм.
- С помощью пипетки равномерно распределите 2 мкл высоковязкого цианоакрилатного клея по капилляру, начиная с металлической иглы и заканчивая на 10 мм выше нижнего конца капилляра, как показано на рисунке 1.
- С помощью стереотаксического робота опускайте иглу до тех пор, пока кончик металлической иглы не окажется на 1 мм над исходной поверхностью. Таким образом, капилляр из плавленого кремнезема будет закреплен в металлической игле, образуя шаг в 1 мм от кончика. Удалите излишки клея, образующиеся на конце металлической иглы, чтобы не затупить ступеньку.
- Подождите 15 минут, чтобы клей застыл, и снимите шприц с катетером со стереотаксического робота. Убедитесь, что весь излишки клея были удалены на этапе, проверив кончик катетера под микроскопом.
- Тестирование ступенчатого катетера с помощью блока агарозы
- Приготовьте 0,6% раствор агарозы в фосфатно-солевом буфере (PBS) в обычном гелевом лотке и подождите, пока он полимеризуется. Разрежьте агарозу на блоки примерно 20 мм х 20 мм. До начала использования держите блоки погруженными в PBS.
- Вручную наполните шприц ступенчатого катетера 10 мкл 0,4% раствором отфильтрованного трипанового синего цвета.
- С помощью стереотаксического робота дозируйте 1 мкл со скоростью 0,2 мкл/мин, чтобы оценить герметизацию ступени катетера во время процедуры фиксации. Раствор трипанового синего должен быть виден только на кончике катетера. Протрите его бумажной салфеткой.
- Поместите агарозный блок в стереотаксический робот и откалибруйте робота так, чтобы кончик катетера касался поверхности агарозного блока.
- Запрограммируйте параметры инъекции для CED.
- Для объема инъекции 5 мкл используйте следующие шаги: 1 мкл со скоростью 0,2 мкл/мин, затем 2 мкл со скоростью 0,5 мкл/мин и 2 мкл со скоростью 0,8 мкл/мин. Отрегулируйте окончательный объем инъекции в соответствии с конкретным планом эксперимента, пропорционально изменяя продолжительность каждого из этапов.
- Для введения раствора в хвостатый путамен мышиной (стриатум) выполняют такое введение в положении 1 мм фронтально и 1,5–2 мм латерально от брегмы на глубине 3,5 мм.
- После инъекции оставьте катетер на месте на 2 минуты, а затем втяните его со скоростью 1 мм/мин, чтобы обеспечить надлежащее рассеивание жидкости в мозге и герметизировать инъекционный тракт во время удаления катетера><.
заметка: Все параметры могут быть запрограммированы в один сценарий в зависимости от конкретного стереотаксического робота.
- Начните процедуру CED и введите 5 μл раствора трипанового синего в агарозный блок.
- Оцените форму облака трипанового синего цвета в агарозе и возможную утечку по катетерному тракту. Трипановый синий должен образовывать эллипсоид или круглое облако с центром вокруг кончика катетера и диаметром не менее 1 мм. Не должно быть видно значительного обратного потока над кончиком металлической иглы.
- Установите новую агарозную блокаду и начните вторую инъекцию 1 мкл со скоростью 0,2 мкл/мин, чтобы оценить закупорку катетера агарозой. Трипановый синий должен снова начать образовывать облако с кончика катетера сразу после начала инъекции.
- Оцените, соответствует ли остаточный объем в шприце 3 мкл. Любые отклонения могут указывать на утечку жидкости через крепление катетера или поршень шприца.
- Если все пробные инъекции прошли успешно, катетер хорошо герметизирован и прям, и из других мест, кроме кончика катетера, не наблюдается раствора трипанового синего, промойте катетер деионизированным H2O (dH2O) до тех пор, пока не станут видны следы трипанового синего цвета, а затем промойте десять раз следующим образом: 70% этанол и 100% этанол с последующей повторной промывкой 70% этанолом и чистой деионизированной водой.
- Храните катетер в сухих условиях.
2. Конвекционная доставка раствора антитела в мозг мыши
ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от местных правил защиты животных, для этой процедуры могут быть применены различные типы анестетиков, анальгетиков и антибиотиков. В этом протоколе описывается применение инъекционной анестезии. Ингаляционные анестетики, такие как изофлуран, также могут быть использованы путем установки маски для носа на стереотаксическую раму. Кроме того, мы рекомендуем добавлять в питьевую воду антибиотики для профилактики инфекций.
- Хирургическая установка
- Приготовьте обезболивающие и антидотные растворы. Мышей можно безопасно обезболить с помощью трехкомпонентной анестезии, содержащей фентанил (0,05 мг/кг), мидазолам (5 мг/кг) и медетомидин (0,5 мг/кг), разведенных в стерильной дистиллированной воде (dH2O). Мы проводим двухэтапную процедуру пробуждения с использованием двух антидотных растворов, один из которых содержит флумазенил (0,5 мг/кг) и бупренорфин (0,1 мг/кг) в стерильном dH2O (первый антидотный раствор). Второй содержит атипамезол (2,5 мг/кг) в стерильном dH2O (раствор второго антидота).
- Приготовьте раствор для обезболивания, содержащий карпрофен (5,667 мг/кг), разведенный стерильным dH2O.
- Очистите стереотаксическую рамку, грелку и элементы стереотаксического робота. Имейте в виду, что не все детали робота можно чистить без риска повреждения. Обратитесь к руководству по роботу для получения подробной информации об очистке и подготовке к использованию.
- Соберите шприц со ступенчатым катетером и промывайте его несколько раз dH2O, 70% этанола и 100% этанола, а затем снова промывайте 70% этанолом и dH2O. Наконец, промойте шприц PBS или другими буферами, чтобы приготовить раствор для внутричерепного введения, например, искусственной спинномозговой жидкости. Поршень шприца должен двигаться плавно и свободно во время процедуры.
- Откалибруйте программное обеспечение стереотаксического робота с помощью стереотаксической рамки.
- Протестируйте программное обеспечение стереотаксического робота, убедившись, что манипуляторы робота свободно двигаются, что инжекционный насос правильно подключен и что он может выполнять процедуру CED без каких-либо помех. Это включает в себя тестирование движения робота, наращивание инъекций, проверку 2-минутного шага ожидания и проверку скорости втягивания катетера. Все параметры должны соответствовать заранее запрограммированной процедуре CED, описанной в. 1.3.5.
- Вставьте сверло в сверло. Перед использованием сверла рекомендуется стерилизовать.
- Приготовьте раствор антитела с использованием PBS или других буферных растворов, таких как искусственная спинномозговая жидкость (aCSF). От 1 до 20 мкг антитела в 5 мкл могут быть введены за одну процедуру КЭД. Другие объемы и количества белка должны быть проверены перед проведением эксперимента. Имейте в виду, что использование высоковязких растворов может привести к засорению катетера.
- Вручную загрузите в шприц разведенное антитело.
- Введение антител методом CED в стриатум
- Взвесьте мышь и введите трехкомпонентный раствор для анестезии в брюшину в соответствии с массой тела. Обратите внимание на время инъекции. Перенесите мышь в отдельную клетку, подогретую грелкой.
- Понаблюдайте за мышью, чтобы определить, когда начинается седативный эффект. Когда мышь перестает двигаться, нанесите на глаза офтальмологическую мазь, чтобы защитить роговицу от высыхания во время операции. Полная седация обычно начинается через 10–15 минут после введения трехкомпонентного раствора для анестезии.
- Проверьте болевые реакции с помощью щипкового рефлекторного теста, чтобы убедиться в полной анестезии животного.
- Побрейте голову с помощью триммера для волос.
- Продезинфицируйте кожу ватными тампонами, смоченными в растворе йода. Трижды потрите кожу круговыми движениями.
- Сделайте разрез кожи на 10 мм вдоль средней линии черепа, закончив скальпелем на уровне глаз.
- Зафиксируйте мышь в стереотаксической рамке с помощью носового зажима и ушных планок. Убедитесь, что поверхность черепа горизонтальна и плотно закреплена. Помимо правильной анатомической навигации, также важно избегать наклона черепа во время сверления и процедуры CED.
- Поместите шприц в стереотаксический робот.
- Синхронизируйте сверло с наконечником катетера в контрольной точке. Соотношение между положением бормашины и шприца должно быть точно определено в программном обеспечении, чтобы инъекция могла быть выполнена в желаемую анатомическую область мозга.
- Втяните кожу с помощью щипцов и локализуйте брегму на поверхности черепа.
- Ссылка на Bregma в программном обеспечении с помощью наконечника сверла.
- Переместите сверло в положение на расстоянии 1 мм спереди и 2 мм сбоку от брегмы и просверлите отверстие для заусенцев. Будьте осторожны, чтобы не повредить твердую мозговую оболочку.
- Наведите шприц на отверстие для заусенца.
- Выдавите 0,5–1 мкл из шприца, чтобы в катетере не осталось пузырьков воздуха.
- Запустите программу CED, описанную в пункте 1.3.5. Осмотрите поверхность черепа на предмет следов обратного потока жидкости из места инъекции. Следите за частотой дыхания животного.
- После завершения программы CED и извлечения катетера из головного мозга запустите инъекционный насос со скоростью 0,2 μL/мин, чтобы проверить наличие закупорки катетера во время CED. Если закупорки не произошло, вы должны немедленно увидеть каплю инъекционной смеси с наконечника катетера.
- Перед повторным использованием или хранением катетера визуально осмотрите катетер под микроскопом на наличие признаков повреждения или износа и очистите его, как описано в пункте 1.3.10.
