1. Культура клеток микроглии BV-2
ПРИМЕЧАНИЕ: Обрабатывайте клетки BV-2 в соответствии с уровнем биобезопасности 2. Клеточная линия BV-2 продуцирует оболочечный рекомбинантный экотропный ретровирус (способный заражать только клетки мышей); Такие вирусы известны своей способностью к трансформации in vitro и опухолевым потенциалом in vivo.
- Культивирование клеток BV-2 в модифицированной среде Dulbecco (DMEM) с высоким содержанием глюкозы с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 2 мМ L-глутамина (далее именуемого культивирующей средой) путем посева клеток в концентрации 4 x 104 клеток/мл.
- Выдерживайте культуры во влажной атмосфере с содержаниемCO2 5% при 37 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: клетки растут слабо прикрепленными и во взвешенном состоянии.
2. Маркировка рекомбинантных тау-агрегатов с помощью pH-чувствительного флуоресцентного красителя
ПРИМЕЧАНИЕ: Агрегаты Tau были подготовлены, как описано в Apetri et al.с той разницей, что в реакционный буфер не добавляли тиофлавин T (ThT). Агрегированные пробы собирали в центрифужные пробирки объемом 1,5 мл. Окончательный сигнал флуоресценции проверяли путем смешивания 118 мкл образца бассейна с 12 мкл 50 мкМ раствора ThT. Агрегаты разделяли центрифугированием смеси для реакции агрегации при 20 000 x g в течение 1 ч при 4 °C. Надосадочная жидкость была проанализирована с помощью SEC-MALS, чтобы подтвердить, что весь мономерный тау был преобразован в агрегаты. Пеллеты (тау-агрегаты) замораживали и хранили в морозильной камере при температуре -80 °C.
- Ресуспендируйте тау-агреги в 0,1 М буфере бикарбоната натрия (NaHCO3) при pH 8,5 до концентрации 1 мг/мл (~ 20 μM).
заметка: Концентрация агрегатов тау основана на исходной концентрации мономеров, оцененной по поглощению мономеров тау на длине волны 280 нм с использованием коэффициента экстинкции 0,31 млмг-1 см-1.
- Во избежание перегрева ресуспендированные агрегаты произведите ультразвуковую обработку с помощью ультразвукового аппарата-зонда, удерживая их на льду.
- Используйте амплитуду 65% (при ультразвуковой обработке мощностью 250 Вт).
- Выполните 8 импульсов по 3 с с паузами 15 с между импульсами во избежание перегрева.
- Приготовьте 8,9 мМ стоковый раствор pH-чувствительного красителя (далее именуемого pH-красителем) в диметилсульфоксиде (ДМСО) в соответствии с инструкцией производителя.
заметка: Всегда готовьте свежий раствор и используйте его только в день приготовления.
- Добавьте 10 молей красителя на моль белка до конечной концентрации красителя 0,2 мМ.
- Перемешивайте, аккуратно пипетируя вверх и вниз.
- Инкубировать реакционную смесь в течение 45–60 мин при комнатной температуре, в защищенном от света месте.
- Тем временем соберите колонну для обессоливания геля с поперечными связями в соответствии с инструкциями производителя.
- Уравновесьте колонку 25 мл 0,1 М NaHCO3 буфера pH 8,5, содержащего 3% ДМСО. Откажитесь от сквозного потока.
- Добавьте в колонку продукт реакции мечения тау-агрегата в общем объеме 2,5 мл. Если размер образца меньше 2,5 мл, добавляйте буфер до тех пор, пока не будет достигнут общий объем 2,5 мл.
- Дайте образцу полностью войти в упакованный гель, отбросьте проточный.
- Разбавьте 3,5 мл 0,1 М NaHCO3 буфером pH 8,5, содержащим 3% ДМСО, и соберите элюат в 4 эквивалентные фракции в 2 мл пробирки.
- Определите концентрацию белка 4 фракций с помощью анализа бицинхониновой кислоты (БЦА).
- Храните маркированный белок в морозильной камере при температуре -20 °C.
3. Анализ поглощения с флуоресцентно-активируемой сортировкой клеток (FACS)
- День 1 – Засейте клетки
- Промойте клетки BV-2 в колбе, удалив питательную среду и добавив 1x фосфатно-солевой буфер (PBS).
заметка: Объем стирки будет варьироваться в зависимости от размера используемой клеточной колбы. Например, для колбы T175 промойте 10 мл 1x PBS.
- Удалите PBS из колбы и отделите клетки путем инкубации с трипсин-этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА) 0,05% при 37 °C и 5% CO2 до тех пор, пока клетки не отделятся от колбы (примерно через 5 мин).
заметка: Объем трипсина-ЭДТА 0,05% зависит от размера используемой клеточной колбы. Например, для колбы T175 используйте 2 мл трипсина-ЭДТА 0,05%.
- Ресуспендируйте клетки в культурируемой среде путем пипетирования вверх и вниз от трех до пяти раз.
ПРИМЕЧАНИЕ: Объем питательной среды варьируется в зависимости от размера используемой клеточной колбы и, следовательно, общего количества ячеек в колбе. Например, для колбы T175 используйте 8 мл питательной среды.
- Подсчитывают клетки и создают клеточную суспензию с конечной концентрацией 1 х 105 клеток/мл в культуральной среде, содержащей 200 мкг/мл гепарина.
- Планшет 250 мкл клеточной суспензии (2,5 x 104 клеток) на лунку в 96-луночном планшете с плоским дном для культуры тканей.
- Инкубируйте тарелку в течение ночи при 37 °C и 5%CO2.
- День 1 – Готовим иммунокомплексы
- Разморозьте pH-краситель на льду.
- Приготовьте 65 мкл в одном кондиции 500 нМ раствора pH-агрегатов красителя-тау в бессывороточной среде (СЗМ) (ДМ с высоким содержанием глюкозы с добавлением 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 200 мкг/мл гепарина).
- Готовят разведения антител в 65 мкл SFM в концентрации, вдвое превышающей конечную. Смешайте агрегаты pH-красителя-тау и антитела в 96-луночной U-образной нижней пластине. Конечный объем в расчете на кондицию теперь составляет 130 мкл, а концентрация pH-агрегатов красителя-тау составляет 250 нМ. Закройте планшет для разбавления и инкубируйте в течение ночи при 37 °C.
- День 2 – Усвоение иммунокомплексов
- Удалите питательную среду из клеток BV-2. Промойте ячейки один раз при комнатной температуре 100 μL 1x PBS.
- Перенесите 125 мкл иммунокомплексов в клетки с помощью многоканальной пипетки. Клетки с иммунокомплексами инкубируют в течение 2 ч при 37 °C и 5%CO2.
- Извлеките из клеток инкубационную среду и выбросьте ее. Промойте ячейки один раз при комнатной температуре 100 μL 1x PBS.
- Удалите 1x PBS и обрабатывайте клетки 50 мкл трипсина-ЭДТА 0,25% в течение 20 мин при 37 °C и 5% CO2.
- Добавьте 200 мкл питательной среды и хорошо ресуспендируйте пипетированием вверх и вниз для отделения клеток. Переведите ячейки на 96-луночную U-образную донную пластину. Центрифужная тарелка при 400 x g в течение 5 мин при 4 °C.
- Положите пластину на лед, удалите питательную среду и дважды промойте ячейки, повторно суспендируя гранулы клеток в 150 мкл ледяного 1x PBS. Центрифужная тарелка при 400 x g в течение 5 мин при 4 °C.
- Положите клетки на лед, удалите добавленный 1x PBS и промойте их, повторно суспендируя гранулы клеток в 150 мкл холодного буфера FACS (1x PBS, 0,5% бычьего сывороточного альбумина (BSA), 2 мМ ЭДТА). Центрифужная тарелка при 400 x g в течение 5 мин при 4 °C.
- Поместите клетки на лед, удалите добавленный буфер FACS и повторно суспендируйте элементы в холодном буфере FACS объемом 200 мкл.
- Немедленно проанализируйте образцы с помощью FACS, регистрируя 2 x 104 события в затворе живых клеток (см. шаг 4.1).
