1. Очистка антител
ПРИМЕЧАНИЕ: Уравновешивающий буфер для собственного антитела составляет 25 мМ Трис, 100 мМ NaCl, pH 7,5. Используемый буфер для элюирования составляет 0,1 М уксусной кислоты. Буферы и смола (белок А) зависят от очищенного специфического антитела. Объем колонны эквивалентен высоте слоя смолы. Количество используемой подвижной фазы определяется с точки зрения объема колонны.
- Инициализация системы очистки
- Откройте программное обеспечение, подключенное к системе очистки. Используя ручную инструкцию, уравновесьте колонну с уравновешивающим буфером при расходе 2 мл/мин в течение 40 мин. Остановите ручной ход после балансировки.
- Поместите в сборник фракций конические пробирки объемом 15 мл для сбора очищенного элюата антител и конические пробирки объемом 50 мл для сбора проточного раствора во время промывки с высоким содержанием соли. Убедитесь, что сборщик фракций сброшен в исходное положение, открывая и закрывая его перед началом прогона. Коллектор фракций поддерживается при температуре 7 °C.
заметка: Сборщик фракций можно сбросить вручную на вкладке «Сборщик фракций» в настройках для пробирок объемом 15 мл и 50 мл.
- Впрыск образца
заметка: Собранная жидкость для культивирования клеток, используемая в следующих процедурах, была получена из клеток яичников китайского хомяка, культивируемых в автоматизированных микробиореакторах.
- Добавьте отфильтрованную жидкость для сбора урожая 0,22 мкм в пустой шприц объемом 12 мл, конец сопла которого закрыт.
- Держа шприц насадкой вниз, вставьте поршень шприца до тех пор, пока небольшая часть поршня не войдет внутрь. Убедившись, что жидкость не вытекает, поверните шприц насадкой вверх и снимите колпачок.
- Все еще держа шприц соплом вверх, нажмите на цилиндр, чтобы рассеять воздух, пока жидкость для клеточной культуры не окажется на кончике сопла. Вставьте насадку шприца в отверстие для ручного впрыска на системе очистки и поверните для затяжки.
- Нажимайте на поршень до тех пор, пока весь образец не будет введен и не станет видимым в прилагаемой петле для образцов большого объема объемом 10 мл.
- Откройте сохраненный файл метода. Сохраните файл результата в нужном месте и укажите имя файла при появлении запроса. Нажмите кнопку run после того, как образец был введен в петлю выборки большого объема.
- Запуск метода очистки
- Выберите сохраненный метод и нажмите кнопку «Выполнить» при появлении запроса программным обеспечением прибора (шаг 1.2.5).
заметка: Система настроена на выполнение следующих шагов. Пользователю не нужно ничего делать во время работы прибора.
- Уравновесьте колонну тремя объемами колонны (CV) уравновешивающего буфера при расходе 2 мл/мин. После того, как колонна уравновешивается, система, используя контур отбора проб большого объема, будет впрыскивать пробу в колонку со скоростью потока 1 мл/мин.
- Падение УФ-сигнала на длине волны 280 нм указывает на то, что загрузка образца завершена. Промыть колонку уравновешивающим буфером со скоростью потока 2 мл/мин до тех пор, пока УФ-сигнал не упадет ниже 25 мЕ.
- Используйте четыре CV по 25 мМ Tris с 1 М NaCl при pH 7,5 для проведения вторичной промывки с высоким содержанием солей со скоростью потока 2 мл/мин. Системный сборщик фракций соберет любой белок/ДНК, который выходит из колонки во время промывки солью, в пробирках объемом 50 мл.
- Нанесите пять CV элюирующего буфера со скоростью потока 1 мл/мин, чтобы вымыть антитело из колонки. Соберите элюат в пробирки объемом 15 мл на основе УФ-сигнала; когда сигнал UV 280 выше 35 мАЕ, начинается сбор; сбор заканчивается, когда сигнал падает ниже 50 мАЕ; Это называется пиковой резкой.
заметка: Пиковая резка обеспечивает нормализацию профилей элюирования и предотвращение элюирования пиковых хвостов, которые могут содержать белковые агрегаты.
- Промойте колонку, используя три CV уравновешивающего буфера. Прогон заканчивается после этапа стирки.
- После элюирования немедленно нейтрализовать очищенный белок с помощью 1 М Трис-основания до pH ~5,5. Измерьте концентрацию белка с помощью микрообъемного УФ-ВИД спектрофотометра при длине волны 280 нм и 260 нм и храните при 4 °C.
