Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.
ЧАСТЬ 1: Создание диссоциированных, фетальных, грызунов, нейрональных культур гиппокампа грызунов
1. Подготовительные шаги
- Покрытие поли-L-лизином (ФАПЧ) поверхностей гальванического покрытия (за 3 дня до рассечения)
- Приготовьте боратный буфер, добавив 2,38 г борной кислоты и 1,27 г буры в 500 мл дистиллированной воды и перемешивая в течение 15 мин до растворения. Под колпаком стерилизуйте буферный раствор путем фильтрации (размер пор 0,2 мкм), пометьте этикеткой и храните при комнатной температуре (RT).
заметка: Этот раствор стабилен и может использоваться в течение 6 месяцев.< чел/>
ВНИМАНИЕ: При приготовлении боратного буфера надевайте рекомендуемые средства индивидуальной защиты.
- Приготовьте исходный раствор ФАПЧ (100 мг/мл), добавив 1 г ФАПЧ на 10 мл дистиллированной воды и перемешав до растворения. Приготовьте 500 мкл аликвот исходного раствора ФАПЧ. Чтобы достичь конечной концентрации 1 мг/мл, добавьте 500 мкл аликвоты ФАПЧ к 50 мл боратного буфера и перемешайте до растворения, а затем стерилизуйте раствор путем фильтрации (размер пор 0,2 мкм).<бр/>
заметка: Этот раствор стабилен и может использоваться в течение 6 месяцев.
- Подготовьте поверхности к нанесению покрытия. Используйте покровные стекла диаметром 12 мм для процедур иммуноокрашивания и чашки со стеклянным дном для исследований, которые будут включать визуализацию живых нейронов. Если вы используете покровные листы, проведите автоклав, а затем поместите по пять покровных листов в каждую посуду (диаметром 3,5 см).<бр/>
заметка: Толщина покровного стекла влияет на качество и интенсивность сигнала получаемых изображений. Большинство объективов микроскопа рассчитаны на покровные стекла #1.5. Выберите подходящие покровные стекла в соответствии с настройкой и техникой съемки.
- Под колпак добавьте по 1,5 мл раствора ФАПЧ в каждую посуду (посуду со стеклянным дном или посуду 3,5 см с пятью покровными листами). Убедитесь, что все покровные стекла погружены в воду и хранятся в RT в течение 24 часов.
- За 2 дня до вскрытия аспирируйте раствор ФАПЧ и промойте стерильной водой, не содержащей эндотоксинов, убедившись, что покровные стекла погружены в воду. Держите воду в посуде и храните при температуре RT в течение 24 часов.
- За 1 сутки до вскрытия аспирируйте воду и замените ее питательными средами NB + B27 (см. ниже), а посуду поместите в инкубатор при температуре 37 °C на 24 ч.
- Приготовление питательной среды и исходного раствора (за 1 сутки до вскрытия)
- Модифицированная орлиная среда Дульбекко (DMEM): К 500 мл DMEM с высоким содержанием глюкозы (4,5 г/л) без L-глютамина и фенолового красного добавьте 50 мл лошадиной сыворотки, 50 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS), 10 мл L-глутамина (200 мМ), 10 мл пирувата натрия (100 мМ), 10 мл пенициллин-стрептомицина (10 000 ЕД/мл). Профильтровать (размер пор 0,2 мкм) и хранить в 5 мл аликвот при 4 °C с плотно закрытым колпачком
заметка: Этот раствор стабилен и может использоваться в течение 1 месяца.
- Нейробазальная (NB) среда с добавлением B27 (NB + B27): К 50 мл NB среды без фенола красного добавить 1 мл добавки B27.
- Среда Hibernate-E с добавлением B27 (Hibernate + B27): К 50 мл среды Hibernate-E добавьте 1 мл добавки B27.
- Внеклеточный физиологический раствор (EPS): В 1 л стерильной воды добавьте следующие вещества в указанных конечных концентрациях: NaCl (140 мМ), KCl (3,5 мМ), N-(2-гидроксиэтил)пиперазин-N'-(2-этансульфоновая кислота) (HEPES, 10 мМ), глюкозу (20 мМ) и CaCl2 (2 мМ). Перемешайте до растворения и отрегулируйте pH до 7,4, добавив NaOH (0,5 M) или HCl (0,5 M). Под колпаком стерилизовать путем фильтрации (размер пор 0,2 мкм) и хранить при температуре 4°C.
- Оборудование и другие лабораторные материалы (день вскрытия)
- Установите водяную баню на 37 °C. Нагрейте следующие аликвоты: 50 мл сбалансированного солевого раствора Ганкса (HBSS) и 5 мл DMEM.
- Простерилизуйте следующие инструменты, погрузив в стакан с абсолютным этанолом (Рисунок 1B): щипцы, изогнутые щипцы, ножницы, тонко изогнутые щипцы, тонкие прямые щипцы, хирургические ножницы, тонкоугольные щипцы и прецизионные пружинные ножницы><.
заметка: Чтобы защитить инструменты, поместите на дно стакана мягкий материал (например, салфетки для научной точности).
- Наполните два лотка льдом и положите туда следующие предметы.
- Лоток для льда 1 (Рисунок 1C): Поместите хирургические инструменты в стакан с абсолютным этанолом, стакан с HBSS для промывки хирургических инструментов, 10-сантиметровую чашку с HBSS для размещения эмбрионов, 6-сантиметровую чашку с HBSS для размещения голов эмбрионов и 6-сантиметровую чашку с Hibernate + B27 для размещения мозга эмбрионов.
- Лоток для льда 2: Поместите аликвоту трипсина 2,5% объемом 1 мл и чашку диаметром 3,5 см с Hibernate + B27 для рассеченного гиппокампа.
заметка: Время, необходимое для этой процедуры, зависит от опыта исследователя и количества эмбрионов, которые необходимо препарировать. Поэтому лед должен оставаться замороженным в течение необходимого количества времени. Для этой цели рекомендуется использовать полистирольные лотки.
2. Рассечение и посев (Рисунок 1)
- Изоляция гиппокампа
заметка: Беременные крысы с эмбрионами на эмбриональный день 18 (E18) усыпляются непосредственно перед началом протокола в соответствии с местным этическим комитетом Университета Барселоны в соответствии с европейскими (2010/63/UE) правилами использования и ухода за экспериментальными животными. В этом протоколе вдыхание углекислого газа (СО2) использовалось в качестве метода эвтаназии.
- Рассеките крысу на уровне брюшной брюшины с помощью щипцов и ножниц. Извлеките матку вместе с эмбрионами E18 и поместите ее в 10-сантиметровую посуду, охлажденную на льду><.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно избегать прикрепления шерсти крысы к эмбрионам. Рекомендуется использовать обильное количество 70% этанола для стерилизации брюшной полости. Начиная с этого шага, работайте внутри вытяжки на лотке для льда 1.
- Откройте мешочки для эмбрионов и перенесите эмбрионы в 10-сантиметровую чашку с HBSS, убедившись, что эмбрионы полностью погружены.
- Удалите головку эмбриона ножницами и поместите ее в 6-сантиметровую посуду с HBSS. Повторите этот процесс со всеми эмбрионами.
заметка: Чтобы избежать загрязнения, все ткани, за исключением головок эмбриона, следует выбросить в контейнер с завинчивающейся крышкой.
- Удерживайте головку эмбриона тонко изогнутыми щипцами и прокалывайте глазницы парой тонких прямых щипцов, входящих под углом 45°, а затем отпустите тонко изогнутые щипцы.
заметка: Щипцы не должны проходить через мозг, поэтому важно соблюдать угол при вводе.
- Рассеките кожу и череп хирургическими ножницами, начиная с затылочной кости до лобной кости. Удалите мозг с помощью пары тонко изогнутых щипцов и поместите его в чашку диаметром 6 см с Hibernate + B27. Повторяйте этот процесс до тех пор, пока все мозги не восстановятся.
- Сагиттально разделяйте конечный мозг тонкопрямыми щипцами.
заметка: Начиная с этого этапа, диссекция гиппокампа проводится под стереомикроскопом. Рекомендуется использовать шарнирно-сочлененные лампы таким образом, чтобы свет освещал поверхность вскрытия с боков. Также рекомендуется использовать черный фон, так как это обеспечивает больший контраст, позволяя лучше различить гиппокамп.
- Приготовьте блюдо длиной 10 см, поместив капли Hibernate + B27 на расстоянии 1 см (например, по кругу). Поместите один конечный мозг на каждую каплю Hibernate + B27 и визуализируйте через препарирующий эндоскоп (рекомендуется увеличение объектива в 1,25 раза).
- Тщательно очистите мозговые оболочки и удалите таламус, чтобы лучше визуализировать гиппокамп.
- Рассеките гиппокамп прецизионными пружинными ножницами и поместите его в чашку диаметром 3,5 см с Hibernate + B27 в лотке для льда 2. Повторяйте для каждого конечного мозга, пока не будут собраны все гиппокампы.
- Осторожно соберите все гиппокампы с помощью пастеровской пипетки и перенесите их в пробирку объемом 50 мл.
заметка: При сборе гиппокампа принимайте минимальный объем Hibernate + B27, чтобы не разбавлять трипсин.
- Диссоциация клеток
- Ферментативная диссоциация гиппокампа
- В 50 мл пробирки, содержащей гиппокамп, добавьте 1 мл 2,5% трипсина и доведите его до объема 5 мл с помощью HBSS. Выдерживать в течение 15 минут на водяной бане при температуре 37 °C.
- Чтобы развести трипсин, добавьте 10 мл предварительно подогретого HBSS и выдерживайте 5 минут на водяной бане при 37 °C.
- Перенесите гиппокампы, которые теперь выглядят в виде слизистой массы, в пробирку объемом 50 мл с помощью микропипетки объемом 1000 мкл, добавьте 6 мл предварительно нагретого HBSS и инкубируйте в течение 5 минут на водяной бане при 37 °C.
- Механическая диссоциация гиппокампа
- Переложите массу в пробирку объемом 2 мл с коническим дном, взяв минимальный объем. Добавьте 1 мл предварительно нагретого материала DMEM. Гомогенизируйте гранулу с помощью микропипетки объемом 1 000 мкл, осторожно отсасывая вверх и вниз.
заметка: Очень важно избегать образования пузырьков при аспирации, так как пузырьки могут лизировать клетки.
- Повторите аспирацию вверх и вниз с помощью предварительно вытянутой стеклянной пипетки (10x-20x), кончик которой должен соприкасаться с коническим дном трубки. Избегайте образования пузырей. В конце этого этапа смесь должна быть полупрозрачной.
- После однородного смешивания до полупрозрачности смеси переложите смесь в пробирку, содержащую 4 мл среды DMEM при температуре 37 °C, и гомогенизируйте с помощью стеклянной пипетки путем пипетирования вверх и вниз.
- Посев клеток
- Посчитайте клетки. Количество нейронов в растворе можно подсчитать в соответствии со стандартными лабораторными процедурами.
заметка: В экспериментах по визуализации для обнаружения антител и активности кальция оптимальной является концентрация 50 000 клеток на чашку размером 3,5 см.
- Удерживая ячейки в подвешенном состоянии, извлеките расчетный объем и подавайте в посуду диаметром 3,5 см с покрытием PLL или в посуду со стеклянным дном с покрытием PLL.
- Равномерно распределите ячейки по посуде, мягко встряхивая перекрестными движениями (вперед-назад, затем из стороны в сторону; повторяйте по мере необходимости) и поместите посуду в инкубатор сСО2 (5%)<бр/>
заметка: Важно использовать перекрестные движения, чтобы избежать оседания клеток на периферии блюда.
- Каждую неделю вносите примерно 1 мл NB + B27, чтобы культура не пересыхал><а.
заметка: Через 2 недели (14 дней in vitro [div]) нейроны созревают и экспрессируют все факторы, которые можно использовать для экспериментов. Общее среднее количество нейронов, полученных с использованием этого протокола, составляет примерно 2,5 х 106 нейронов, поступающих в среднем от 12 эмбрионов Е18 на одну беременную крысу.
ЧАСТЬ 2: Использование культур нейронов гиппокампа для обнаружения антител в белках поверхности нейрональных клеток
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта часть протокола демонстрирует, как культуры гиппокампа используются для идентификации антител против NMDAR в сыворотке и/или спинномозговой жидкости пациентов с энцефалитом, направленным против NMDAR. Флуоресцентное иммуноокрашивание используется для визуализации реактивности живых нейронов, но могут быть использованы и другие методы визуализации. Подходящим контролем для этого эксперимента будет сыворотка или спинномозговая жидкость здорового человека. При использовании образцов на людях имейте в виду, что может потребоваться одобрение институционального этического комитета.
3. Живое флуоресцентное иммуноокрашивание
- Используйте 14 делевых клеток, которые были выращены на покровных листах (50 000 клеток на 3,5 см чашки, содержащей пять покровных стеблей).
- Внутри капота промойте покровные стекла NB, предварительно нагретым до 37 °C.
- Добавьте образец, который в данном случае содержит антитела против NMDAR (используемые в качестве основного антитела), разведенные в среде NB в соотношении 1:200 для сыворотки или 1:2 для ликвора, и инкубируйте 1 ч при 37 °C (внутри инкубатора CO2 (5%).
- Тщательно промойте фосфатно-солевым буфером (PBS) 3 раза при RT.
- Добавьте раствор фиксации (4% формальдегид в PBS) и инкубируйте при РТ в течение 5 мин.<бр/>
осторожность: При работе с 4% формальдегидом работайте внутри капюшона и носите рекомендованные средства индивидуальной защиты.
- Промыть 3 раза с PBS по 5 минут каждый.
- Добавьте вторичное антитело Goat anti-Human AF488 в разведении 1:1000 и инкубируйте при ОТ в течение 1 ч.<бр/>
заметка: Во время инкубации защищайте от воздействия света, накрыв алюминиевой фольгой.
- Промыть 3 раза с PBS по 5 минут каждый. Промыть дистиллированной водой
- Установите защитные стекла с помощью жидкого монтажного материала (например, антивыцветающего монтажного материала DAPI; примерно 7 μл), отсадите оставшуюся жидкость и промойте дистиллированной водой. Теперь нейроны готовы к флуоресцентной визуализации.
осторожность: При работе с монтажным носителем надевайте рекомендованные средства индивидуальной защиты.
