Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все шаги должны выполняться в BSL2 hood, если не указано иное. Перед проведением анализа нейтрализации бляшек (PRN) требуется титрование вируса для определения оптимальной концентрации РСВ, используемой в анализе PRN. Рекомендуется выделять запасы вируса в небольшом объеме, который будет разморожен один раз и использован для каждого анализа NAb. Также рекомендуется использовать один и тот же вирусный материал для всех анализов NAB, выполненных для всех образцов из одного исследования. Убедитесь, что питательные среды и фосфатно-солевой буфер (PBS) нагреты до 37 °C перед добавлением их в клеточные планшеты.
1. Титрование вируса РСВ
ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от количества вирусных запасов и количества дубликатов, тестовая пластина может быть настроена в соответствии с рисунком 1. Каждый вирусный запас следует титровать в трех количествах вниз по анализируемому планшету, начиная с максимальной концентрации вируса (т.е. 1:10). Последовательное титрование обычно может составлять 1:10. Процедуры культивирования и поддержания клеточного культивирования A549 и культивирования РСВ проводятся с использованием стандартных процедур и не включены в данный протокол.
- Высевающие пластины (День 1)
- Ресуспендируйте клетки A549 в среде Dulbecco's Modified Eagles (DMEM) + 10% эмбриональной сыворотки теленка (FCS) + 1000 МЕ пенициллина/стрептомицина (пен/стрептококк) в дозе 4 x 105/мл. Затравить 96-луночные стерильные планшеты с плоским дном объемом 100 мкл/лунку, содержащие 4 x 10 4 ячейки A459.
- Инкубируйте планшеты в течение ночи при 37 °C, 5% углекислого газа (CO2) (клетки будут находиться в логарифмической фазе роста).
заметка: Используйте новый флакон с клетками A549 после 23 проходов. Рекомендуется не начинать эксперименты, когда новая клеточная пробирка еще находится на первых трех проходах.
- Вирусная инфекция (день 2)
- Приготовление серийного разведения вируса
- Быстро разморозьте один замороженный флакон респираторно-синцитиального вируса (РСВ) на водяной бане при температуре 37 °C до почти полного оттаивания и немедленно положите на лед. Подготовьте 3 репликации для каждого тестируемого запаса вируса РСВ, используйте исходное разведение вирусного запаса в соотношении 1:10 со 100 мкл разведенного вируса/лунки и зарезервируйте по крайней мере одну колонку для отрицательного контроля.
ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1 показан отрицательный контроль в трех экземплярах.
- Добавьте по 100 мкл каждого разведенного вируса в соотношении 1:10 в тройном ряду А стерильной пластины с U-образным дном на 96 лунок. Добавьте 90 мкл/лунку DMEM + 1000 МЕ ручка/стрептококк без FCS в ряды от B до H.
- Выполните последовательное разведение 1:10 вниз по планшету, переливая 10 мкл из ряда А в ряд В. Смешайте раствор, пипетируя содержимое вверх и вниз 5 раз, и продолжайте десятикратное разведение до ряда Н. Отбросьте последние 10 мкл так, чтобы конечный объем в каждой лунке составил 90 мкл<бр/>
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно использовать новые насадки для каждого разведения.
- Инокуляция вируса на клетки А549
- Извлеките пластину (пластины) ячейки A549, подготовленную накануне. Убедитесь, что монослои ячеек A549 в 96-луночных планшетах на ~80% сливаются. Выбросьте носитель, аккуратно перевернув пластину и слегка промокнув ее стерильным впитывающим бумажным полотенцем.
- Промойте все лунки 100 мкл PBS дважды; выбросьте излишки PBS, аккуратно перевернув пластину и слегка промокнув на стерильном впитывающем бумажном полотенце после каждой стирки. Не допускайте высыхания пластин.
- Перенесите разведения вируса с планшета для титрования вируса (рис. 1) в соответствующие лунки на клеточной пластине A549. Инкубируйте планшет в течение 1 часа при 37 °C, 5% CO2. После 1 ч инкубации надосадочную жидкость сцедить с помощью пипетки (во избежание перекрестного загрязнения). Выньте 90 μл/лунку.
- Добавьте в каждую лунку 100 μл 1x medium 199 (M199, см. Таблицу материалов) + 1,5% карбоксиметилцеллюлозную натриевую соль (CMC) низкой вязкости + 2% FCS, содержащую перо/стрептококк.
ПРИМЕЧАНИЕ: 2x M199 + 4% FCS + 2% пен/стрептококк и 3% растворы CMC должны быть приготовлены и храниться при температуре 4 °C для использования в будущем. Перед добавлением в тарелки убедитесь, что раствор нагрет до 37 °C.
- Приготовьте 2x раствор M199: 1 пакетик/500 мл дистиллированной воды + 20 мл FCS + 10 мл ручки/стрептококка (чтобы получить 2x MI99). Отфильтруйте раствор с помощью фильтрующей установки 0,22 мкм.
- Для приготовления 3% КМЦ медленно добавьте 15 г КМЦ в 500 мл дистиллированной воды. Растворите CMC в воде с помощью металлической мешалки при температуре 50 °C, на приготовление которой уходит около 1 часа. Хорошо перемешайте, чтобы получилось 3% CMC, и автоклавируйте раствор.
ПРИМЕЧАНИЕ: Твердое вещество CMC необходимо добавить в растворяемую воду; Добавление воды к сухому твердому веществу дает «комок» твердого вещества, который очень трудно растворить.
- Приготовьте 1x M199 + 1,5% CMC низкой вязкости + 2% FCS, содержащий перо/стрептококк, смешав 1:1 2x M199 и 3% CMC, приготовленный на этапе 1.2.2.4.2.
- Выдерживать в течение 3 дней при 37 °C, 5% CO2.
- Разработка пробирной пластины и анализ (День 5)
- Фиксация и проявка пробирной пластины
- Выбросьте M199 + CMC + 2% FCS, содержащий ручку/стрептококк, аккуратно перевернув пластину. Медленно (чтобы не нарушить клеточный слой) добавьте 200 мкл фиксирующего буфера (80% ацетона, 20% PBS, хранящегося при -20 °C) для фиксации клеток. Выдерживать при температуре -20 °C в течение 20 минут.
- Выбросьте фиксирующий буфер и аккуратно промокните его на впитывающем бумажном полотенце. Оставьте тарелку сушиться лицевой стороной вниз на 10 минут. <бр/>
заметка: Начиная с этого этапа, анализ может быть выполнен вне колпака BSL2.
- Приготовьте 5% раствор для блокировки молочного разбавителя в фильтрованном PBS, содержащем 0,05% полисорбата 20 (PBS-полисорбат, см. Таблицу материалов). Рассчитайте объем, необходимый для блокировки для одной пластины из расчета 200 /лунка и 110 лунок: 200 μл/лунка x 110 лунок = 22 мл (1,1 мл концентрированного молочного разбавителя в 20,9 мл фильтрованного PBS-полисорбата). На этом этапе также составляют достаточный блокирующий раствор для первичных и вторичных антител. Рассчитайте объем, необходимый для каждого раствора антитела для одного планшета, исходя из 50 мкл/лунка и 110 лунок: 50 мкл/лунка x 110 лунок = 5,5 мл. Таким образом, общий объем раствора для блокировки молочного разбавителя, необходимый для анализа на одном планшете, составляет 33 мл.
- Добавьте 200 μл/лунку раствора для блокировки. Инкубируйте планшет при комнатной температуре (RT) в течение 30 минут. Слейте раствор, аккуратно перевернув пластину, и промокните на впитывающем бумажном полотенце.
- Приготовьте антитело к РСВ 1:500 Goat X (mAb – первичное антитело), разведенное в блокирующем растворе. Добавьте 50 μл/лунку раствора mAb и инкубируйте при 37 °C в течение 1 ч. Вымойте тарелку 3 раза отфильтрованным PBS-полисорбатом.
- Приготовьте 1:5 000 Alexa-Fluor ослик против коз IgG (вторичное антитело), разведенное в блокирующем растворе. Добавьте 50 μл/лунку раствора вторичного антитела и инкубируйте при 37 °C в течение 1 ч. Вымойте тарелку 5 раз отфильтрованным PBS-полисорбатом.
- Считывайте показания пластины на автоматическом считывателе с использованием канала флуоресцеина изотиоцианата (FITC) и настроек подсчета, как показано на рисунке 2. Заверните планшет в фольгу и храните при температуре 4 °C. Откалибруйте прибор с помощью неиспользованного 96-луночного планшета для культивирования и введите настройки подсчета перед анализом.
заметка: При необходимости возможно повторное сканирование в течение нескольких дней. Настройки калибровки и подсчета могут быть сохранены и использованы для последующего сканирования, если в анализе используется тот же тип пластины, который использовался для калибровки.
- Проверьте изображения скважин на наличие артефактных бляшек или разрушенных монослоев клеток (Рисунок 3). Исключите лунки с нарушенными монослоями ячеек.
заметка: В зависимости от размера бляшек артефактов, может потребоваться ручной подсчет для этих скважин или эти скважины могут быть исключены из анализа данных. Критериями достоверного результата являются отсутствие разрушенного монослоя клетки или артефактных бляшек, обнаруженных более чем в одной реплицируемой лунке, и отсутствие бляшечных единиц (PFU), обнаруженных в отрицательных лунках (лунках без добавления вируса).
- Определение концентрации вируса
- Выбирайте последние два разведения, где пятна можно четко посчитать. Рассчитайте среднее количество пятен из повторных скважин при одном и том же разубоживании. Рассчитайте титр вируса (PFU на мл) образца материала по следующей формуле:
PJE/мл = Среднее количество бляшек/(Коэффициент разбавления × Объем разбавленного вируса, добавленного в лунку)
заметка: Концентрация вируса, определенная для каждого запаса РСВ, теперь может быть использована в анализе PRN (шаг 2).
2. Анализ нейтрализации РСВ
- Высевающие пластины (День 1)
- Ресуспендируйте клетки А549 в DMEM + 10% FCS + 1000 МЕ пен/стрептококк в концентрации 4 x 105/мл. Засейте 96-луночные стерильные планшеты с плоским дном объемом 100 мкл/лунку, содержащие 4 x 10 4клетки A459, и инкубируйте планшеты на ночь при 37 °C, 5%CO2 (клетки будут находиться в логарифмической фазе роста).
заметка: Используйте новый флакон с клетками A549 после 23 проходов. Не рекомендуется использовать ячейки А549 перед проходом No3.
- Подготовка вирусов и сывороток (День 2)
заметка: В зависимости от типа образца существуют необходимые этапы предварительной обработки образцов перед анализом NAb. Рекомендуется использовать сыворотки международного стандарта РСВ, которые в настоящее время доступны по запросу в Национальном институте биологических стандартов и контроля (NIBSC).
- Приготовление разведения сыворотки крови
- Разморозьте образцы референтной антисыворотки РСВ человека (сыворотки сравнения, REF) и тестовых образцов сыворотки в режиме РТ. Нагрейте образцы сыворотки и антисыворотки на водяной бане при температуре 56 °C в течение 30 минут перед использованием. Приготовьте разведение в соответствии с шаблоном планшета (Рисунок 4).
- Приготовьте разведение REF в соотношении 1:100. Приготовьте минимум 110 мкл REF, разведенного в DMEM + pen/strep без FCS на одну пластину для анализа (например, 1,5 мкл REF в общем объеме 150 μл). Добавьте 110 мкл разбавленного REF в соотношении 1:100 в лунку A12 96-луночного U-образного стерильного планшета.
- Добавьте 55 мкл DMEM + шприц/стрептококк без FCS в лунки от B12 до H12 в столбце 12. Выполняйте последовательное разведение 1:2 вниз по планшету, переливая 55 мкл из ряда А в ряд В, смешивая раствор пипетированием вверх и вниз 5 раз и продолжая до ряда Н. Отбросьте последние 55 мкл среды так, чтобы конечный объем в каждой лунке составил 55 мкл. Используйте новые наконечники для каждого разведения.
- Приготовьте разведение образцов сыворотки в соотношении 1:100. Поскольку все образцы сыворотки анализируются в трех экземплярах, приготовьте минимальный объем 110 мкл/лунка x 3 = 330 мкл на исследуемый образец сыворотки.
- Добавьте по 110 мкл каждого разбавленного образца сыворотки (1:100; S1 = сыворотка 1, S2 = сыворотка 2 и т.д.) к соответствующим лункам от А1 до А9, а также от Е1 до Е9 96-луночного стерильного планшета в соответствии с фиг.4.
- Добавьте 55 мкл DMEM + шприц/стрептококк без FCS во все лунки, помеченные X. Выполните последовательное разведение 1:2 в соответствии с шагом 2.2.1.3 до строки D (для образцов 1, 2 и 3). Слейте последние 55 мкл среды так, чтобы конечный объем в каждой лунке составлял 55 мкл. Аналогично выполните последовательное разведение в соотношении 1:2 для образцов 4, 5 и 6 для рядов от E до H.
заметка: Для каждого разведения важно использовать новые типсы.
- Добавьте 55 мкл DMEM + шприц/стрептококк без FCS в лунки в столбцах 10 и 11.
- Подготовка вируса
- Быстро разморозьте один замороженный флакон РСВ на водяной бане при температуре 37 °C до почти полного оттаивания и немедленно положите на лед.
- Разведите вирус в DMEM + pen/стрептококк без FCS на основе концентрации аликвоты RSV, определенной на шаге 1.3.2. Нанесите разбавление, которое дает примерно 200 БОЕ/лунку. Подготовьте общий объем 5,5 мл (на 100 лунок).
- Приготовление вирусно-сывороточной смеси
- Добавьте 55 мкл разведенного вируса во все лунки столбцов 1-9 и лунки рядов E-H столбцов 10 и 11 (положительный контроль) согласно шаблону планшета (рис. 4).
- Добавить 55 мкл DMEM + шприц/стрептококк без FCS во все лунки рядов A-D столбцов 10 и 11 (отрицательный контроль). Инкубируйте планшет в течение 1 часа при 37 °C, 5% CO2.
- Инокуляция вируса на клетки А549
- Перед завершением инкубационного периода извлеките клеточную пластину (пластины) A549, подготовленную на шаге 2.1.1. Убедитесь, что монослои ячеек A549 в 96-луночных планшетах на ~80% сливаются.
- Выбросьте носитель, аккуратно перевернув пластину и слегка промокнув ее стерильным впитывающим бумажным полотенцем. Промойте все лунки 100 μL PBS дважды, выбросьте излишки PBS, аккуратно перевернув пластину и слегка промокнув на стерильном впитывающем бумажном полотенце после каждой стирки. Не допускайте высыхания пластин.
- Перенесите 100 мкл/лунку вирусно-сывороточной смеси в соответствующие лунки на клеточной пластине A549 в соответствии с шаблоном планшета. Инкубируйте планшет в течение 1 часа при 37 °C, 5% CO2.
- Через 1 час с помощью пипетки выньте 90 л/лунку и добавьте 100 мкл предварительно подогретого 1x M199 + 1,5% CMC + 2% FCS + ручка/стрептококк. Инкубировать в течение 3 дней при 37 °C, 5% CO2,
заметка: Перед добавлением в тарелки убедитесь, что раствор нагрелся до 37 °C.
- Разработка пробирной пластины и анализ (День 5)
- Разработайте пластину для фиксации и анализа, следуя шагам с 1.3.1.1 по 1.3.1.8.
- Определение титра нейтрализации 50%
- Определите титр нейтрализации 50%, рассчитав пропорциональное расстояние между взаимными разведениями сыворотки выше и ниже 50% контрольных лунок «без сыворотки» (положительный контроль вируса - столбец 10, строки E-H).
- Подсчитайте количество БОЕ (т.е. бляшек), возникающих в результате отдельных вирусных инфекций в лунках сыворотки и без контрольных лунок сыворотки. Рассчитайте среднее количество PFU в контрольных лунках без сыворотки и определите значение 50%.
- Определите разведения сыворотки с количеством непосредственно выше и ниже 50% значения контрольных лунок без сыворотки. Используя полулогарифмический график или шаблон электронной таблицы, нанесите на график количество PFU по оси x (линейная шкала) и обратное разведение сыворотки по оси y (масштаб log10). Проведите линию между двумя точками и считайте с этой линии 50% титры нейтрализации образцов исследуемой сыворотки.
